小尾寒羊肠道正常菌群高通量测序分析及羊源微生态制剂的研制

【摘要】：动物的肠道菌群具有营养与代谢,免疫与保护,维持肠道菌群平衡,改善肠道环境,促进动物生长发育等作用,动物在一些应激(冷、热、惊吓、长途运输、细菌和病毒等)状态下,肠道菌群会发生紊乱,继而动物发生腹泻,免疫功能降低,生长指标下降等,给养殖业带来巨大的经济损失。小尾寒羊是我国优质的皮肉兼用型地方绵羊品种之一,因其具有躯体高大、性早熟、耐粗饲、生长发育快、繁殖率高、抗病力强、遗传性能稳定、适应性广等优良特性,而被广泛饲养。然而随着饲养规模的扩大,消化道类疫病多发,特别是细菌性疾病。而且目前缺少良好的治疗方法,尽管抗生素能治疗消化道类疫病,但会打破肠道菌群平衡状态,造成肠道菌群紊乱以及细菌耐药性的产生。微生态制剂作为抗生素的辅助治疗剂,有无残留、无耐药性、无毒副作用、效果显著、不污染环境等优点,其不但能防病治病、提高饲料转化率和畜禽生产性能,还可以改善动物健康状况。但是目前缺少羊专用的微生态制剂,我们对羊肠道菌群的了解也不够深入。目前对肠道菌群的研究多应用传统的分子生物学技术,如实时荧光定量PCR和变性梯度凝胶电泳(DGGE),这些方法不仅耗时而且工作量大,且只能检测出一定丰度以上的微生物,对复杂的肠道微生物群的研究不够全面,而Illumina高通量测序技术能够测序到肠道中所有微生物DNA序列,全面分析肠道微生物群落的多样性和丰度,以满足我们对肠道微生物群落的认识。因此,本试验采用Illumina Mi Seq的高通量测序技术对小尾寒羊肠道菌群的组成和多样性进行分析,并以分析的结果为依据,对小尾寒羊肠道细菌进行筛选,最后用筛选出的菌株研制成了微生态制剂,并对微生态制剂的效果进行了检验。通过Illumina Mi Seq的高通量测序技术对小尾寒羊空肠、盲肠和直肠样本中菌群组成、α多样性、β多样性和样本聚类等方面进行了分析研究,结果显示:在样本菌群组成方面,小尾寒羊盲肠和直肠中主要细菌为Bacteroides(拟杆菌属),Ruminococcus(瘤胃球菌属),Lactobacillus(乳杆菌属),Incertae_Sedis和Flavonifractor;空肠中主要细菌为Lactobacillus(乳杆菌属),Chloroplast,Incertae_Sedis,Acetitomaculum和Ruminococcus(瘤胃球菌属);小尾寒羊空肠菌群组成与个体差异有关,而盲肠和直肠菌群组成相对来说比较稳定,与个体间的差异相关性不大。在样本菌群变化趋势方面,可以推测出,从小尾寒羊的十二指肠端到直肠端,乳杆菌属的丰度越来越小,拟杆菌属的丰度越来越大。在α多样性分析方面,小尾寒羊盲肠和直肠的细菌丰度和多样性都大于空肠,而盲肠和直肠间的差异性不显著。在β多样性和样本聚类分析方面,小尾寒羊盲肠和直肠中细菌群落在进化上的相似度较高,而前两者与空肠中细菌群落相似度较低。依据高通量测序的分析结果,采用传统的生物学方法对小尾寒羊肠道中的细菌进行分离鉴定,并对分离的菌株进行生长性能、耐酸耐胆盐和抑制有害菌生长等方面的筛选,结果显示:筛选出3株生长速度快、对酸和胆盐耐受力强、抑菌效果好的菌,分别为M1(干酪乳杆菌)、M2(植物乳杆菌)和L1(枯草芽孢杆菌),将这3株菌发酵混合后制成微生态制剂,并通过饲喂小白鼠,检验微生态制剂的安全性,结果表明:所研制的微生态制剂是安全的。将研制的微生态制剂分别按低(3 m L/只/d)、中(6 m L/只/d)、高剂量组(12 m L/只/d)混饮给予家兔,并对家兔生长性能和免疫功能方面的相关指标进行检测,结果表明,研制的微生态制剂可以提高家兔平均日增重,降低料肉比,提高血清中兔瘟抗体水平、血清中IFN-γ和溶菌酶浓度,其中,中高剂量组效果最明显(P0.05),且中、高剂量组间的差异不显著(P0.05)。将研制的微生态制剂饲喂腹泻羊,并以腹泻对照组和健康对照组进行对照,经过5天的调理治疗后,腹泻试验组的羊全部恢复正常,由此证明研制的微生态制剂对腹泻羊具有很好的治疗和调理作用,可以在实际生产中进行推广应用。