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对人工饲料不同摄食性家蚕品种(品系)SSR标记分析及pkg1基因的表达研究

崔海波  
【摘要】:家蚕作为重要的经济昆虫,在人类生产生活及文化历史上均有非常重要的地位。而家蚕是寡食性昆虫,桑叶是其天然饲料,栽桑才能养蚕,这制约了蚕桑业的发展。用人工饲料养蚕是蚕业史上的一项重要的技术革新,是今后我国养蚕业发展的方向。但目前我国人工饲料养蚕技术尚未达到实用化的要求,现行蚕品种对人工饲料的摄食性较差是制约该技术发展的主要障碍,提高家蚕对人工饲料的摄食性和适应性成为研究的重点。前人已从生理学和遗传学等方面对家蚕食性做了大量的研究,并取得了丰硕的成果,但家蚕食性相关的分子机理尚未完全明确,与家蚕摄食性相关的“食性基因”尚未获得。本研究以对人工饲料摄食性差异明显的家蚕品种(品系)为材料,利用微卫星标记(Simple Sequence Repeats,SSR)技术对家蚕食性相关的分子标记进行分析。并采用实时荧光定量PCR方法测定了环磷酸鸟苷依赖性蛋白激酶基因1(c GMP dependent protein kinase gene 1,pkg1)在人工饲料摄食性不同的家蚕品种(品系)中的表达特征,采用药物激活PKG的方法对pkg1基因进行功能验证,以期探明PKG与家蚕食性的关系。主要获得如下结果:1.以广食性家蚕品种中广04和低食性家蚕品种鲁七、菁松A高食性品系和低食性品系、菁松B高食性品系和低食性品系3对对人工饲料摄食性存在很大差异的家蚕品种(品系)为材料,利用152对SSR分子标记引物对供试家蚕品种(品系)进行SSR-PCR扩增,共筛选出18个多态性SSR特异标记,主要位于第3、7、9、10、12、13、14、16、17、19、20和21号染色体上。20号染色体上的SSR标记最多,为3条,且多由高食性家蚕品种(品系)扩增出来,说明促进家蚕摄食人工饲料的基因可能位于20号染色体上,并且S2009为高食性家蚕品种(品系)的特异性引物,这进一步说明促进家蚕摄食的基因很可能位于20号染色体的S2009标记附近。S1902也多为高食性家蚕品种(品系)的特异引物,说明在19号染色体的S1902位点附近也有可能存在与食性相关的基因。S0911和S1603多为低食性家蚕品种(品系)的特异引物,说明抑制家蚕摄食的基因有可能位于9号染色体的S0911和16号染色体的S1603位点附近。由此推测,家蚕食性相关性状可能受多基因控制,属于数量性状。并且不同家蚕品种(品系)的摄食性基因可能存在一定差别,食性的遗传模式也将不同。2.以广食性家蚕品种中广04、菁松A和菁松B高食性家蚕品系及菁松A和菁松B低食性家蚕品系的3龄起蚕头部为材料,检测摄食性不同的家蚕品种(品系)中pkg1基因的表达特征。pkg1在高食性家蚕品种(品系)中的表达量均显著高于低食性品种(品系)。pkg1基因在5龄96 h家蚕的组织表达特异性测定表明,该基因在家蚕头部、中肠、脂肪体、马氏管及丝腺中均有表达,其中在脂肪体中的表达量最高,马氏管次之,在头部和中肠中的表达量最低。3.对广食性家蚕品种中广04、低食性家蚕品种鲁七、菁松A高食性和低食性家蚕品系4龄起蚕进行饥饿处理,均会导致pkg1基因的表达量显著升高。分别用桑叶、不含桑叶粉的人工饲料和忌避剂(樟脑)对这4种家蚕品种(品系)进行气味刺激,然后检测家蚕头部pkg1基因的表达变化。结果表明,桑叶、不含桑叶粉的人工饲料和忌避剂的气味刺激对pkg1基因在不同品种(品系)中的表达影响不同,桑叶气味刺激能使高食性和低食性家蚕品种(品系)之间的pkg1表达差异减小;不含桑叶粉的人工饲料刺激引起低食性品种(品系)pkg1的表达量显著下调,使高、低食性家蚕之间的pkg1表达差异增大;樟脑对不同品种(品系)pkg1基因的表达影响较小。本试验结果说明,pkg1可能与家蚕的食性有密切关系,可能具有促进家蚕摄食人工饲料的功能,其具体机理有待于进一步研究。4.给4龄起蚕44 h的菁松B高食性家蚕幼虫添食不同浓度的8-Br-c GMP,结果显示,随着8-Br-c GMP浓度的增加,家蚕对人工饲料的摄食性显著降低。给5龄起蚕24 h的优食一号家蚕幼虫注射不同浓度的8-Br-c GMP溶液,结果表明,当注射浓度为500μM、1000μM和5000μM时,家蚕对人工饲料的摄食性随着注射浓度的增加而显著变差,并且当注射浓度为5000μM时,家蚕出现中毒现象,在注射48 h后恢复正常。给5龄起蚕24 h的优食一号家蚕幼虫注射不同浓度的c GMP溶液,家蚕对人工饲料的摄食性并无显著变化。因此,pkg1基因与家蚕食性相关的功能需要采用其他方法进一步验证。


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