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一氧化氮对采后肥城桃果实能量代谢及CBF抗冷途径的调控机理

张小康  
【摘要】:桃是广受消费者喜爱的水果之一,桃果实采后不易贮藏,冷藏是目前应用最广的桃果实保鲜方式之一,但桃属于冷敏性果蔬,低温贮藏容易使其发生冷害,影响其经济效益。一氧化氮(NO)作为活性气体小分子,能够缓解采后桃果实的冷害,提高采后桃果实的抗冷性,但其调控机理并不明确。因此,探明NO对采后桃果实抗冷性的调控机理,从而为NO在桃果实贮藏保鲜技术的应用提供理论依据,对于保持果实品质,延长贮藏期具有重要意义。能量状态与采后水果的成熟、衰老及生理失调紧密相关,冷害的发生与能量亏缺有着密切联系。为了研究NO处理在桃果实冷藏期间对其能量代谢的调控机理,选取八成熟肥城桃果实,分别用去离子水(对照)、5、15、30μmol L-1 NO溶液和5μmol L-1 2-(4-羧苯基)-4,4,5,5-四甲基咪唑啉-1-烃氧基-3-氧化钠盐(c-PTIO,NO清除剂)溶液处理后于0°C恒温贮藏。分别在果实储藏当天、第1、2、3、4、5周测定不同处理肥城桃果实冷害指数,硬度,丙二醛(MDA)、过氧化氢,腺苷三磷酸(ATP)、腺苷二磷酸(ADP)、磷酸单腺苷(AMP)的含量和能荷水平的变化,以及琥珀酸脱氢酶(SDH)、细胞色素氧化酶(CCO)、氢离子ATP酶(H+-ATPase)、钙离子ATP酶(Ca2+-ATPase)等线粒体呼吸代谢关键酶的活性变化情况。结果表明,在冷藏过程中,桃果实内ATP、ADP含量,能荷水平及桃果实线粒体内SDH、CCO、H+-ATPase、Ca2+-ATPase酶活性逐渐降低,而AMP、过氧化氢及MDA含量升高;与对照相比,NO处理能够显著延缓桃果实内ATP、ADP、能荷含量及能量代谢酶活性的降低,抑制过氧化氢、MDA、AMP含量的上升,其中以15μmol L-1 NO处理桃果实最为显著,而NO清除剂c-PTIO处理则加剧了桃果实ATP、能荷含量及能量代谢酶活性的下降以及过氧化氢、MDA、AMP含量的上升。上述结果表明,15μmol L-1外源NO处理能有效维持桃果实在冷藏期间的能量代谢,延缓膜脂过氧化过程,提高桃果实的抗冷性,而c-PTIO处理则促进了冷藏期间桃果实能量代谢紊乱,加剧了桃果实的冷害程度。植物具有接受低温刺激信号、自我调节抗冷机制以低于低温的能力。低温刺激信号沿着“细胞膜上的蛋白受体→Ca2+等第二信使→蛋白激酶→转录因子→抗冷基因”的途径逐级在植物细胞传递。CBF(C-repeat binding transcription factor/de-hydrate responsive element binding factor,DREB)基因是植物CBF抗冷途径的枢纽。植物在抗冷过程中通过CBF转录因子调控大量下游抗冷基因的表达来提高植物抗冷能力。本研究从肥城桃桃果实提取出总RNA并克隆获得cDNA并测得了肥城桃的CBF家族基因序列。对CBF家族基因进行荧光定量分析发现,在冷藏过程中,桃果实CBF1/5/6基因表达量迅速升高,且均维持在较高的水平,相对于对照,NO处理显著提高了冷藏过程中CBF1/5/6的基因表达量,而c-PTIO通过清除NO,使CBF1/5/6的基因表达量略低于对照,证明了NO对于CBF抗冷途径的调控作用。以克隆获得的cDNA为模板,构建pET30a-CBF重组载体,导入大肠杆菌BL21(DE3)进行蛋白表达,表达出了CBF1~3蛋白。为进一步从分子生物学方面探讨NO抗冷机制打下基础。


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