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布鲁氏菌强启动子的筛选及重组口蹄疫病毒VP1基因的表达

孙翠丽  
【摘要】:布鲁氏菌病(Brucellosis,简称布病)是由布鲁氏菌引起的一种重要的人兽共患病,2012年我国国务院印发了《国家中长期动物疫病防治规划(2011-2020年)》,将布病列为优先防治的国内16种动物疫病之一,并作为当前防控工作的重中之重。该病对畜牧业和人类健康均构成严重威胁,使用疫苗免疫是防控布氏菌病的重要措施之一。目前,我国用于控制布病的疫苗主要是S2株(猪型2号苗),其具有毒力较弱、免疫效果良好、安全性高等特点。布鲁氏菌能够引起机体强烈的Th1型免疫应答,这使得布鲁氏菌成为理想的异源性抗原载体,为了开发出能高效表达外源基因的布鲁氏菌活载体疫苗,在本课题中我们首先使用绿色荧光蛋白作为报告基因,将布鲁氏菌组成型启动子Psod、Pdnaj和Pdnak分别克隆入YGT-p BBR1mcs2,得到重组表达载体YGTp BBR1mcs2-Pdnaj、YGT-p BBR1mcs2-Psod和YGT-p BBR1mcs2-Pdnak并转化至布鲁氏菌。荧光显微镜检测GFP蛋白的表达情况。结果表明,3种不同强度的启动子均能在布鲁氏菌S2中启动GFP基因的表达且启动能力由强到弱依次为:Pdnak、Pdnaj、Psod。口蹄疫(Foot and mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus,FMDV)引起的偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病,该病可引起偶蹄类动物的口、足等部位皮肤出现水泡而造成部份动物死亡,严重影响畜牧产业的发展。VP1蛋白是FMDV的主要结构蛋白,是病毒感染细胞的关键,具有与细胞受体结合的位点。口蹄疫VP1蛋白可作为研制口蹄疫基因工程疫苗的首选抗原。本研究以猪种布鲁氏菌S2株为亲本株,利用蔗糖自杀质粒载体,将FMDV的VP1基因表达框部分替代了布鲁氏菌wbo A基因,成功构建了重组口蹄疫病毒VP1基因的布鲁氏菌病活疫苗。使用荧光定量PCR的方法对重组菌的VP1基因的转录情况进行检测,发现VP1基因在宿主菌内有显著的转录变化,说明口蹄疫病毒VP1基因在m RNA水平上表达。将重组菌与原始菌灭活后进行超声破碎,行进Western Blot验证,结果显示,重组菌比原始菌多出一条分子量大小为30k Da左右的条带,与VP1蛋白理论大小一致,证明了口蹄疫病毒VP1在布鲁氏菌体内的表达。本研究初步筛选了布鲁氏菌的启动子,并对其强弱进行验证;初步建立了以猪种布鲁氏菌为载体表达外源基因的方法,为布鲁氏菌基因工程活载体疫苗的进一步研究奠定了基础。


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