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烟草内源沉默抑制子NgRBP参与HR反应的分子机制研究

李文菁  
【摘要】:RNA沉默是真核生物用以抵抗病毒和外来核酸入侵的特异性RNA降解机制。针对这一防御机制,病毒通过编码沉默抑制子,保证其成功侵染。越来越多的研究表明,植物本身也编码内源沉默抑制子参与RNA沉默的调控,其沉默抑制功能似乎与RNA沉默的抗病毒防御作用相矛盾,但其存在意义与作用机制尚不清楚。因此,对内源沉默抑制子的研究有助于深入了解RNA沉默的调控机制及病毒与寄主间复杂的互作关系。心叶烟是含有N基因的亚类烟草,烟草花叶病毒(TMV)侵染会引发心叶烟强烈的过敏反应(HR),在叶片上形成明显坏死斑,而心叶烟编码的内源沉默抑制子NgRBP受TMV侵染诱导,推测其可能参与心叶烟的抗病反应。本研究利用瞬时侵染系统超表达及病毒诱导的基因沉默技术(VIGS)下调表达NgRBP后接种TMV,研究NgRBP对抗病反应的影响,结果发现,NgRBP能够增强并提前诱发HR反应。由于HR反应迅速,涉及植物细胞内多种生理生化过程,因此,采用密集时间间隔取样法监测HR反应发生过程中相关基因的表达变化,探讨NgRBP增强HR反应的分子机制。主要研究结果如下:(1)NgRBP能够抑制瞬时侵染介导的RNA沉默,影响沉默途径关键基因的表达。在本生烟16c叶片中瞬时共表达NgRBP和GFP,侵染区5dpi时仍有较强的绿色荧光,同时几乎检测不到GFP siRNA,这说明NgRBP能够抑制瞬时侵染介导的RNA沉默。对沉默相关基因的检测发现,瞬时表达NgRBP时,DCL1及AGO6的表达量明显下降,表达量只相当于空载体对照的40%左右。NgRBP与DCL1启动子GFP融合表达载体共侵染时,GFP mRNA积累量明显少于空载体对照。但NgRBP融合GFP表达载体侵染本生烟,染色体免疫共沉淀(ChIP)显示,NgRBP并不结合DCL1启动子,这说明NgRBP通过下调沉默途径关键基因实现沉默抑制功能,NgRBP对DCL1水平的影响可能需要其他转录因子的参与。(2)NgRBP能增强TMV引发的HR反应及系统获得抗性。TMV侵染心叶烟能引发HR反应,产生枯斑,并诱导NgRBP的表达。瞬时超表达NgRBP后接种TMV,与空载体对照相比,枯斑变小,数量减少,边缘褐化加重。台盼蓝染色及3,3′-二甲基联苯胺(DAB)染色也表明,超表达NgRBP的接种区死细胞减少,H_2O_2积累量增加,TMV积累量减少,病程相关蛋白基因PR1,PR2,PR5的表达明显提高。这说明NgRBP能够增强TMV介导的HR反应。TMV二次接种实验表明,与空载体侵染植株相比,NgRBP超表达植株上部叶片TMV枯斑变小,数量减少,病毒积累量也明显减少,病相关蛋白基因PR1,PR2,PR5的表达水平提高。VIGS下调NgRBP后,TMV诱发的HR反应及SAR均弱于正常心叶烟植株,更弱于NgRBP瞬时超表达植株。上述结果说明,NgRBP不但增强TMV引发的局部HR反应,亦能增强植株的系统获得抗性。(3)超表达NgRBP提前引发HR反应。NgRBP瞬时侵染心叶烟叶片后接种TMV,36hpi出现肉眼可见枯斑,比空载体侵染提前8h,比TMV直接接种提前12h。TMV积累量分析表明,瞬时超表达NgRBP的心叶烟叶片,TMV前期积累更迅速,提前达到峰值,但由于诱发了更强的HR反应,TMV总体积累水平较低。HR反应标志基因hin1,hsp203在瞬时超表达NgRBP时提前诱导表达,同时活性氧(ROS)合成相关基因RbohA,RbohB及水杨酸(SA)合成相关基因pal的表达水平明显提高,并提前到达峰值,而ROS清除相关基因POD表达水平明显降低,进一步说明NgRBP的确促进了HR反应提前发生。VIGS下调NgRBP表达后,TMV积累滞后,速度趋缓,由于触发较弱的HR反应,总体病毒积累量较高,上述各基因的诱导表达比超表达NgRBP处理滞后。以上结果说明,NgRBP在TMV侵染初期因其沉默抑制功能促进了TMV的积累,从而加速N基因与TMV的识别,使HR反应提前发生,而ROS及SA积累增多,限制了TMV的复制扩增,减少枯斑及死细胞的数量。(4)NgRBP增强HR反应诱发的局部及系统性RNA沉默。研究表明,HR反应能够诱发局部及系统性RNA沉默,瞬时共表达NgRBP和GFP后接种TMV,与只侵染GFP对照相比,GFP mRNA积累明显减少,而siRNA积累增多。上述结果表明,NgRBP通过增强HR反应增强了局部RNA沉默。分别瞬时超表达NgRBP及VIGS下调NgRBP表达,植株下部叶片接种TMV的同时上部叶片瞬时侵染GFP,结果发现,NgRBP能够增强HR反应诱发的系统性沉默。推测NgRBP通过促进HR反应增强系统性RNA沉默,HR反应诱导的SAR特别是针对病毒的SAR可能部分通过增强RNA沉默实现。(5)NgRBP可能通过抑制沉默增强HR反应。选取植物、动物病毒来源的两种RNA沉默抑制子,番茄丛矮病毒(TBSV)编码的P19和火鸡孢疹病毒(HVT)编码的HVT063,构建植物表达载体瞬时侵染心叶烟叶片,TMV接种后也出现枯斑变小,数量减少的现象,TMV病毒积累量明显减少,与瞬时侵染NgRBP现象一致。qRT-PCR检测显示,在12hpi,hin1表达均明显高于空载体对照,这表明HVT063,P19均能增强HR反应,因此推测,NgRBP对HR反应的增强作用很可能是通过抑制RNA沉默实现的,并非NgRBP的特异功能。


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