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梨TPS和HMGR基因家族鉴定及PcHMGR1基因功能研究

赵荣荣  
【摘要】:萜类化合物是在植物中广泛存在的一类次生代谢产物,对植物自身的生长发育和植物的防御反应过程起着重要的作用,同时也是植物化感作用的媒介物质。另外,一些萜类化合物如紫杉醇、青蒿素等具有重要的商业和医疗价值。因此,萜类代谢工程目前已经成为次生代谢工程研究的重要部分,对于萜类化合物合成途径中关键酶以及编码各种关键酶基因功能的进一步研究就更为重要。梨是蔷薇科植物中具有代表性的经济作物,目前对梨基因组内萜类合成途径的关键酶基因家族研究较少。梨基因组测序的完成,使得从基因组的角度分析和研究萜类合成途径关键酶基因的家族成为可能。本研究使用生物信息学方法结合梨基因组数据对萜类合成途径中两个关键酶基因(TPS和HMGR)基因家族进行鉴定和系统进化分析,包括蛋白基本性质分析、基因结构分析、蛋白结构域分析以及系统进化分析等,并在此基础上通过荧光定量PCR对发现的4个HMGR基因进行组织表达模式、胁迫响应模式等分析。此外,通过构建PcHMGR1基因表达载体转化拟南芥,对PcHMGR1基因的功能进行探究。主要研究结果如下:(1)基于梨基因组数据信息,通过Blast分析与结构域筛选相结合的方法,以GenBank中已经注册的50条TPS蛋白序列作为查询序列,最终在梨基因组内共鉴定得到33个TPS基因。参考拟南芥中TPS基因的命名方式,将梨TPS基因分别命名为PbrTPS1-PbrTPS33。对梨TPS蛋白序列构建系统进化树进行进化聚类和分析,并将其分为5个亚家族。(2)梨TPS基因的染色体定位结果表明,33个TPS基因家族成员分别定位在梨的8条染色体上。其中,定位到第12条染色体上的TPS基因序列数量最多。在第8条、第10条和第17条染色体上各定位得到一个基因。亚细胞定位结果表明,33个TPS蛋白大部分定位于细胞质,少数分布在线粒体、叶绿体和内质网等;α-螺旋和无规卷曲是其二级结构主要组成元件,β-折叠和延伸链散布其中。(3)使用生物信息学的方法在梨基因组内共鉴定出4个HMGR基因,分别命名为PcHMGR1、PcHMGR2、PcHMGR3和PcHMGR4。分析表明,除PcHMGR3是不稳定蛋白,其余均为稳定蛋白。亚细胞定位分析结果表明,PcHMGR1和PcHMGR3定位于细胞质中,PcHMGR2定位于内质网中,PcHMGR4定位于叶绿体中。系统进化分析结果表明,PcHMGR1和PcHMGR4基因在进化关系上更接近。使用GSDS在线网站进行PcHMGR的基因结构分析,结果表明,PcHMGR1、PcHMGR2和PcHMGR3具有基本一致的外显子内含子结构,PcHMGR1具有4个外显子和3个内含子。(4)将梨HMGR氨基酸序列提交到MEME进行蛋白保守结构域分析,在输出的motif中发现梨HMGR蛋白含有4个保守位点,包括两个HMG-COA结合位点(EMPVGYVQIP和TTEGCLVA)和两个NADP(H)结合位点(DAMGMNM和GTVGGGT)。GO功能注释结果分析表明,4个基因同样注释到以下8个功能组,参与到氧化还原过程、辅酶A的代谢过程和类异戊二烯的合成过程,同时也具有多种结合和催化活性以及和细胞膜系统的相关性。(5)组织表达模式分析结果表明,PcHMGR1在幼叶和茎中的表达量最高,PcHMGR2和PcHMGR3在新生的幼叶和幼芽中表达量最高,PcHMGR4在根中表达量最高。在生物胁迫和非生物胁迫条件下的表达模式分析表明,PcHMGR1和PcHMGR4具有相似的表达模式,PcHMGR2和PcHMGR3表达模式同样高度相似。(6)构建35S启动子启动的真核表达载体转化拟南芥,对转基因植株进行基因组水平和转录水平鉴定,成功获得过表达PcHMGR1的转基因拟南芥植株。萜类代谢途径关键酶基因表达分析结果表明,在幼苗期,AtAACT1和AtHMGR2上调表达外,而在盛花期,AtAACT1、AtAACT2、AtFPS1、AtFPS2以及MEP代谢途径关键酶基因AtDXS上调表达。这些结果表明在拟南芥中过表达PcHMGR1影响了萜类代谢途径上下游其它关键酶基因的表达。(7)过表达PcHMGR1基因提高了拟南芥中萜类代谢产物(如叶绿素、类胡萝卜素)的产生,同时增加了下游挥发性萜类物质的种类。在氧化胁迫处理后,野生型相对于转基因拟南芥表现出更严重的萎蔫失绿情况,转基因株系具有更高的抗氧化酶(SOD、APX和CAT)活性,同时MDA含量显著低于野生型,这表明过表达PcHMGR1提高了拟南芥的抗氧化胁迫能力。


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