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PRL1突变体抑制子IYO调控miRNA合成的分子机制研究

郭徐雷  
【摘要】:micro RNA(miRNA)是广泛存在于真核生物体内的一段长度在18-25nt的非编码RNA,能够在转录后水平调控基因表达,参与植物生长发育、生物和非生物逆境生理等过程。miRNA通过碱基互补配对与靶基因mRNA结合,降解靶标mRNA或抑制其翻译过程从而调控植物生理进程。PLEIOTROPIC REGULATORY LOCUS 1(PRL1)是具有保守WD40结构域的RNA结合蛋白,参与miRNA的合成加工过程。PRL1正向调控miRNA和siRNA在拟南芥中的积累,通过影响DICER-LIKE 1(DCL1)的活性来调控pri-miRNA和dsRNA的加工。prl1-2是PRL1 T-DNA插入突变体,其pri-miRNA表达水平与miRNA积累水平严重下降,表现出严重的发育缺陷。本研究以prl1-2突变体为材料,采用EMS诱变的方法正向筛选能够回复prl1-2突变体表型的双突变体植株,并进行基因克隆和功能研究,获得能够影响miRNA调控通路的新因子。通过一系列的遗传和生化研究,揭示PRL1与新因子之间的相互联系,进一步阐明PRL1调控miRNA合成代谢的分子机制。获得主要结果如下:(1)获得11个prl1-2突变体抑制子。EMS诱变prl1-2突变体种子,种植至M2代进行表型分析筛选能够回复prl1-2突变体表型的株系,获得11个prl1-2突变体抑制子植株。其中P27S1能够回复prl1-2突变体表型,P27S1双突植株长势和野生型Col相比没有明显差异,叶片发育正常,根系发育也完全回复prl1-2突变体短根的表型。Stem-loop RT-PCR检测P27S1中成熟miRNA表达水平发现miR156、miR167、miR171与miR173积累水平明显高于prl1-2,接近Col水平。qRT-PCR检测P27S1双突变体中miRNA初级转录本(pri-miRNA)和miRNA靶标基因表达水平显示主要pri-miRNA(pri-miR167、pri-miR171、pri-miR172)近乎完全回复PRL1突变造成的pri-miRNA水平下降和相关miRNA靶标基因表达水平升高的现象。(2)P27S1编码转录延伸因子IYO。P27S1双突变体与prl1突变体(Ler背景)杂交构建图位克隆群体,粗定位显示突变基因位于第一或第四染色体。P27S1双突变体与prl1-2回交构建回交分离群体,选取P27S1表型的植株98棵进行混池全基因组重测序,重测序结果分析获得4个候选突变基因,分别是At4g38440、At1g53360、At4g33210、At5g04590,通过测序与基因型鉴定等方式证实突变位点基因为At4g38440。At4g38440在拟南芥数据库中对应IYO基因,编码与分化起始相关的转录延伸因子,通过克隆全长基因组序列并转化P27S1,阳性植株均表现出近prl1-2表型,验证了基因克隆的结果。(3)IYO与PRL1、SE(SERRATE)相互作用影响pri-miRNA的加工。通过双分子荧光互补验证转录延伸因子IYO同PRL1之间的相互关系,结果表明IYO能够同PRL1互作。同时IYO与剪接复合体关键组分SERRATE互作,表明IYO影响miRNA的加工过程。


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