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小麦抗赤霉病相关基因的分离和功能研究

苏培森  
【摘要】:小麦赤霉病是由禾谷镰刀菌引起的一种毁灭性的小麦病害,它会造成小麦产量和经济的重大损失。预防小麦赤霉病,揭示其发病机制已成为当务之急。然而,由于小麦赤霉病的抗源非常稀缺,加之其本身机制的复杂性,到目前为止,人们对小麦赤霉病的抗性机制知之甚少。组学作为一种有效的研究工具,可以加速我们对小麦赤霉病抗病机理的研究和了解。本研究以小麦抗赤霉病品种苏麦3号为研究材料,首先对接种不同生理小种禾谷镰刀菌的苏麦3号叶片进行了代谢组和转录组联合分析,并以此为研究基础,挖掘了与小麦赤霉病抗病相关的代谢路径,找到了小麦抗赤霉病的重要基因,初步解析了小麦赤霉病的抗病机理。此外,我们结合转基因等分子生物学技术对小麦抗赤霉病相关基因进行功能验证。主要研究内容如下:1.为了深入了解禾谷镰刀菌感染后,所引起的小麦体内代谢物的变化,我们采用了整合超高效液相色谱(UHPLC)和串联质谱(MS/MS)的代谢组学技术,通过代谢组学分析了接种4种不同禾谷镰刀菌(R40、R64、S52、S66)的小麦品种苏麦3号叶片组织的代谢物变化。首先,在禾谷镰刀菌接种后第4天,我们发现苏麦3号叶片对禾谷镰刀菌R40和R64的抵抗力要强于对S52和S66菌种的抵抗力。随后,我们以fold change≥2和fold change≤0.5的标准进行差异代谢物筛选,共检测到差异代谢物789种。在水处理对照与R40、R64、S52和S66的比较中,分别有215、213、206和198种显著差异积累的代谢产物。在这些表现差异的代谢产物中,共有220种代谢物属于黄酮类(例如,黄酮醇、黄酮、黄烷酮、异黄酮、花青素、儿茶素),28种代谢产物参与了植物激素代谢(例如SA、JA、IAA)的生物合成和信号转导,以及57种代谢物与色胺、酚胺、生物碱或胆碱的代谢有关。2.随后,我们对样品进行了转录组分析。转录组分析采用Illumina HiSeq2000测序平台测序,利用中国春的基因组注释文件作为参考基因组信息,以Pval0.05作为显著差异表达评价标准,进行差异基因的筛选。我们发现禾谷镰刀菌侵染引起大量基因的表达变化。为了更好地了解禾谷镰刀菌感染对代谢物水平与代谢物生物合成途径基因之间的关系,基于皮尔森系数相关性,我们对代谢组以及基于RNA-seq的转录组数据进行了关联分析。联合分析结果显示,在黄酮生物合成途径中共发现了16个基因,其中PAL、PTAL、CL、CYP73A、CYP75B1、ANS和FLS基因均被上调,而CHS和ANR基因则下调。水杨酸途径中富集了15个基因,与对照样品相比,接种叶片中PAL、PTAL、PR1和TGA基因显着上调,而NPR1基因显著下调。生长素路径富集了55个基因,其中AROA、AROC、TRPD、TRP1、TRPA、TRP3、AROK、TAA1、AAO、YUCCA和GH3基因与对照组相比上调,而ALDH、AUX1、TIR1、AUX/IAA和ARF基因表达水平下调。茉莉酸路径富集了22个基因,其中LOX、OPR、AOS、AOC和JAZ1表达上调,而JAR1、COI1和MYC2表达下调。在酚胺和色胺途径基因的表达中,其中三个基因ARD、ODC1、TYNA响应于禾谷镰刀菌感染而被上调。相反,在禾谷镰刀菌侵染后,ARG、PAO和SPE基因显著下调。3.我们的研究发现禾谷镰刀菌的侵染引起生长素的变化。通过外源生长素处理,我们发现生长素可以提高小麦穗部对赤霉病的敏感性,说明生长素路径在小麦抵抗赤霉病过程中扮演负调控的角色。qRT-PCR结果表明,TaTIR1对F.g、SA、JA、IAA和ABA等多种胁迫均有响应。结合代谢组和转录组联合分析结果,我们选择生长素受体基因TaTIR1作为候选基因,并验证了TaTIR1在小麦赤霉病抗性中的作用。与野生型比较,TaTIR1沉默转基因株系对赤霉病的抗性增强。接种禾谷镰刀菌后,TaTIR1沉默转基因品系的禾谷镰刀菌感染病粒数百分比明显降低(约10%)。体视荧光显微镜结果显示,TaTIR1沉默转基因株系与野生型植株穗部小花内部禾谷镰刀菌的侵染方式无明显差异。但扫描电镜结果显示TaTIR1沉默转基因株系能明显抑制禾谷镰刀菌菌丝在穗轴中的延展。为了进一步验证TaTIR1参与小麦FHB抗性的机制,我们利用qRT-PCR分析了已知的TaTIR1下游基因的表达。结果表明,在禾谷镰刀菌侵感染后,TaTIR1调节包括AUX、AUX/IAA、ARF、GH3和SAUR在内的基因的表达。与野生型相比,TaTIR1基因敲除转基因株系中这些基因的转录水平均显著降低(约2-3倍)。因此,我们的研究为小麦如何应对禾谷镰刀菌侵染以及抵抗FHB机理提供了新的见解,同时也说明了TaTIR1的FHB抗性在作物改良中的具有广阔的应用前景。4.小麦对赤霉病(FHB)的抗性主要是通过II型抗性即抑制禾谷镰刀菌在小麦穗子上的延展。短柄草作为一种新型的单子叶模式植物,已证明它与禾谷镰刀菌可以相互作用,但是利用其评价小麦赤霉病II型抗性仍需进一步研究。在我们的研究中,发现禾谷镰刀菌孢子主要在短柄草的雌蕊上萌发,然后菌丝迅速延伸到小花底部并进入穗轴,这与禾谷镰刀菌在小麦穗部的侵染过程相似。然而,短柄草穗轴和小麦的穗轴结构存在差异。我们研究发现,在温度为28℃,湿度为50%-70%的条件下,禾谷镰刀菌接种短柄草穗子后,接种小穗的穗轴节点的感染比例可以作为评价短柄草赤霉病II型抗性的一个重要指标。5.为了验证赤霉菌侵染短柄草模式的可行性,我们构建了转录因子TaTGA2的短柄草过表达转基因株系,发现TaTGA2转基因植株无论在穗部还是叶片中都表现出对禾谷镰刀菌的抗性增强。为了进一步验证TaTGA2在小麦中的赤霉病抗性作用,我们通过BSMV介导的基因沉默技术,发现TaTGA2沉默植株的发病小穗比例大约升高了20%。小麦的赤霉病抗性鉴定结果与短柄草一致。进一步证明了利用短柄草作为作为模式植物进行小麦赤霉病抗性研究的可行性。此外,我们还对另外49份短柄草种质材料进行了赤霉病抗性筛选鉴定,发现了对赤霉病不同抗性的材料,如:Bd21,Bd3-1等。


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