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拟南芥COPⅡ复合体组分Sar1调控花粉发育的研究

梁鑫  
【摘要】:花粉发育是被子植物双受精的前提。COPⅡ复合体介导蛋白质从内质网向高尔基体的运输,有报道表明COPⅡ复合体的组分可以参与孢子体或配子体调控的花粉发育。拟南芥基因组编码的5个不同亚型小G蛋白Sar1,Sar1是COPⅡ复合体的重要组分。之前通过对三种Sar1亚型的DN形式研究发现,尽管Sar1各亚型的蛋白序列非常保守,但其底物特异性可能不同,暗示其功能存在差异。由于使用DN形式不能特异性针对单一亚型,因此本研究利用反向遗传学,通过获得不同Sar1亚型的突变体,揭示不同Sar1亚型间功能的异同之处。获得以下研究结果及结论:(1)Sar1b功能缺失导致雄性不育通过分析Sar1a和Sar1c的T-DNA插入突变体,我们发现Sar1a和Sar1c的单突及双突在营养生长和生殖生长方面与野生型没有差异。我们利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术对Sar1b进行编辑,获得sar1b-1和sar1b-2这两种Sar1b等位突变体,其由于碱基的编辑,在转录本上提前引入了终止密码子。sar1b-1和sar1b-2营养生长与野生型没有差异,然而角果不能延伸。用野生型花粉授sar1b时能够正常结实,暗示sar1b雄性不育。通过对开裂的成熟花药进行亚历山大染色和扫描电镜观察分析,发现sar1b花药不产生花粉,证明sar1b雄性不育。(2)sar1b绒毡层发育从四分体时期开始异常为了确定sar1b雄性不育的具体时期,我们对不同发育时期的花药进行了半薄切片以及超薄切片观察。在四分体时期,sar1b的绒毡层较野生型更为膨大。从单核期到双核期,野生型绒毡层分泌孢粉素,沉积到发育的小孢子表面,形成花粉壁。而sar1b突变体中这些类似孢粉素的物质异常沉积到绒毡层与中层之间的细胞间隙,一部分在花粉囊中游离分布,不能附着到花粉表面形成花粉壁。野生型绒毡层在小孢子发育到三核期时完全降解,而sar1b突变体中仍存在未完全降解的绒毡层,且发育异常的小孢子异常死亡。研究结果表明Sar1b在孢子体调控的花粉发育过程发挥重要作用。(3)sar1b绒毡层细胞程序性细胞死亡(PCD)滞后绒毡层后期通过PCD调控花粉的发育。为了检测Sar1b是否影响绒毡层的PCD,我们进行TUNEL实验。在花药发育的第10期,野生型绒毡层中检测TUNEL信号,表明开始进行PCD。同一时期sar1b没有该信号的产生。相反,发育中的小孢子时常有TUNEL信号产生,暗示小孢子异常死亡。在花药发育的后期,野生型中绒毡层完全降解,而sar1b中仍残留绒毡层细胞。这些结果表明Sar1b参与绒毡层PCD的调控。(4)绒毡层中特异性表达Sar1b部分回补sar1b表型Sar1b是组成型表达基因,而对突变体的分析证明其在绒毡层中发挥调控花粉发育的功能。为了验证绒毡层中表达的Sar1b是否对于花粉发育至关重要,我们构建了绒毡层特异性启动子驱动的Sar1b(Pro_(A9):GFP-Sar1b)对突变体进行回补实验。Pro_(A9):GFP-Sar1b部分互补了sar1b表型,即转基因植株能够产生正常的花粉,证明绒毡层中表达的Sar1b对于花粉发育至关重要。(5)Sar1c可以互补sar1b雄性不育表型尽管Sar1c在绒毡层中也有表达,sar1b单突导致完全的雄性不育,暗示Sar1c并不发挥冗余功能。为了验证二者是否有类似功能,我们构建了Pro_(UBQ10):GFP-Sar1c。该转基因可以完全互补sar1b雄性不育的表型。这一结果表明虽然Sar1b和Sar1c在孢子体调控的花粉发育过程并没有冗余性,然而Sar1c和Sar1b的蛋白功能一致。(6)Sar1b和Sar1c在雄配子体发育过程中功能冗余Sar1b和Sar1c在小孢子中也有较高量的表达,暗示其在雄配子体中发挥功能。通过对双突变体材料sar1b/+;sar1c的分离比分析,发现sar1b;sar1c雄配子体不传代,暗示Sar1b和Sar1c共同调控雄配子体功能。对sar1b/+;sar1c突变体的花粉进行亚历山大染色、DAPI染色、SEM等分析,发现sar1b/+;sar1c突变体有一半的花粉败育。这些结果表明Sar1b和Sar1c共同调控雄配子体的发育。(7)sar1b;sar1c雄配子体发育从第10期开始异常为了确定sar1b;sar1c雄配子体发育出现异常的时期,我们对sar1b/+;sar1c的花药做了半薄切片观察。与sar1b不同,sar1b/+;sar1c花药的绒毡层发育正常,进一步证明sar1b/+;sar1c所产生的败育花粉源于配子体而非孢子体异常。sar1b/+;sar1c花药中部分小孢子在第10期开始出现细胞质降解现象,导致花粉败育。本研究利用不同亚型的Sar1突变体,证明Sar1不同亚型在花粉发育中发挥差异性功能。Sar1a不参与花粉发育的调控,Sar1b在花药孢子体细胞中发挥功能,介导花粉发育,其在花药孢子体细胞中的功能可以被Sar1c替代;雄配子体中表达的Sar1c和Sar1b共同调控花粉发育。


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