生姜姜黄素纯化、脂质体制备及对小鼠溃疡性结肠炎治疗的研究

【摘要】：生姜姜黄素是从生姜中提取的一种天然活性成分,具有消炎杀菌、抗氧化、抗癌等多方面药理作用,但是姜黄素对光照,温度,酸碱等因素较为敏感,这就导致了其在消化吸收过程中极其不稳定,生物利用度低等缺点。脂质体可提高食品成分在体内的生物利用度,促进药物或食品功能成分的吸收和利用。制备姜黄素脂质体提高其稳定性并将其应用到在溃疡性结肠炎(UC)的治疗中,扩宽了姜黄素在药食领域的应用。本课题以优质云南小黄姜为原料,确定最佳姜黄素提取工艺,姜黄素的分离纯化工艺,并测得其三个单体的纯度。通过制备姜黄素脂质体,探究了姜黄素对小鼠溃疡性结肠炎的治疗作用。主要结论如下:(1)以总姜黄素得率为指标,采用乙醇法、微波辅助有机溶剂提取法、超声辅助有机溶剂提取法、酶法、水杨酸钠法五种方法提取生姜中总姜黄素,最终确定超声辅助有机溶剂提取法为本试验最佳提取方法。通过单因素、正交试验优化了生姜中总姜黄素的提取工艺:料液比1:40(g/mL),乙醇体积分数90%,温度50℃,超声时间30 min。该条件下测得生姜中总姜黄素得率为379.35μg/g。(2)将超声辅助有机溶剂提取法提取的总姜黄素依次经絮凝法除杂、大孔树脂吸附法纯化,确定了较佳的纯化工艺:絮凝法除杂的最佳絮凝剂为壳聚糖,絮凝剂添加量3 mL/100 mL,温度30℃,时间2 h,该条件下5 g生姜粉中总姜黄素的保留率为97.35%,除杂量为10.65 mg/100 mL;大孔树脂吸附纯化法筛选出最佳纯化树脂为DM 301树脂,动态吸附条件为最佳上样浓度0.05 mg/mL,最佳洗脱剂为100%乙醇,最佳洗脱流速为500 r/min。(3)利用硅胶柱层析对DM 301树脂纯化后的总姜黄素进行分离纯化,梯度洗脱CHCL3:CH3OH:HCOOH=99:0.6:0.4,97:1.5:0.5,75:24.5:0.5后,得到三个组分。经HPLC分析得到总姜黄素中三个单体的占比为姜黄素:去甲氧基姜黄素:双去甲氧基姜黄素=52.11:43.04:4.85。经峰面积归一法测得姜黄素、去甲氧基姜黄素、双去甲氧基姜黄素的纯度分别为73.8%、70.8%、73.2%。(4)以包封率、粒径和PDI值为指标,比较了薄膜分散发、乙醇注入法及逆向蒸发法制备姜黄素脂质体,最终选用乙醇注入法为最佳脂质体制备方法,通过单因素、正交试验优化脂质体制备工艺为膜材比1:3,pH 6.4,姜黄素添加量0.4 g,PBS浓度10mmol/L,PBS添加量10 mL,该条件下脂质体包封率为96.37%,平均粒径为167.3 nm,PDI%为0.087,Zeta电位为-34.1 mV,TEM显示脂质体为分布均匀,外观圆整的球形小囊泡,姜黄素脂质体制备成功。(5)建立体外释放模型,姜黄素脂质体在胃液中释放率为48%,在此后肠道的释放率累积可达85%。对比姜黄素溶液和姜黄素脂质体在肠胃道模拟消化液中残留量的差异,姜黄素脂质体可将SGF中姜黄素残留量由25%提高到79%以上,将SIF中姜黄素残留量由26%提高到73%以上。(6)采用DSS诱导法建立溃疡性结肠炎小鼠模型,探究姜黄素脂质体对溃疡性结肠炎的治疗作用。姜黄素脂质体可以显著改善溃疡性结肠炎模型小鼠脓血便症状,有效降低小鼠DAI值,缓解小鼠结肠缩短、血便、水肿、溃疡等炎症症状,显著性降低小鼠结肠MPO活性,同时减少MDA、TNF-α、IL-6的含量。