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小麦芽木聚糖内切酶的纯化鉴定及对小麦源阿拉伯木聚糖的降解特性

彭昭君  
【摘要】:小麦及小麦芽是啤酒酿造的传统原料,AX是小麦和小麦芽中主要的NSP。在啤酒生产过程中,AX的分子大小和含量对麦汁和啤酒的粘度、浊度、过滤速度、发泡特性等有重要影响。β-1,4-木聚糖内切酶是最重要的AX降解酶。本文研究了小麦芽中β-1,4-木聚糖内切酶的酶学性质(最适pH、最适温度、pH稳定性、温度稳定性及金属离子对其活性的影响),对小麦芽β-1,4-木聚糖内切酶进行了分离纯化,蛋白质组学鉴定,并研究了纯化酶对小麦源AX的降解作用。研究结果如下:(1)β-1,4-木聚糖内切酶的最适pH值是5.5-6.0;在pH4.5、5.5和6.5条件下,保温30、50、60min十分稳定;最适温度为40℃-45℃,失活温度为75℃;在20℃和40℃条件下,β-1,4-木聚糖内切酶保温120min十分稳定,但在50℃下保温60min,酶活力仅为43.91%,在55℃和60℃下表现出较高的热敏感性;在10mM/L的浓度下,Cu~(2+),Ag~+和EDTA对酶活力有强烈的抑制作用;Ca~(2+),Mg~(2+)和Mn~(2+)对酶活力有温和的抑制作用;K~+,Na~+和Pb~(2+)对酶活力有轻微的抑制作用。(2)采用粗酶液提取、硫酸铵沉淀、阳离子交换层析、两步阴离子交换层析,从小麦芽中分离纯化获得了一种新的β-1,4-木聚糖内切酶。纯化β-1,4-木聚糖内切酶比活力为3.94u/mg,Mr约为58000Da,纯化倍数为9,回收率为0.7%,外切酶(阿拉伯呋喃糖苷酶和木糖苷酶)含量极低。经LC-MS/MS鉴定,纯化酶与小麦中具有GH10结构域的A0A3B6MY89蛋白的匹配度最高,有30个匹配肽段,氨基酸的匹配率达到45.5%。(3)纯化β-1,4-木聚糖内切酶是一种真正的木聚糖内切酶,对高粘度小麦源WEAX有明显的降解作用。经过24h的降解作用,重均分子量为346kDa的WEAX被降解成分子量为126kDa的WEAX,降解体系的粘度从1.30mPa·s下降到1.12mPa·s,WEAX的avDP从2h的25.29下降到16.22。经过电镜扫描,底物WEAX表观结构在降解前形状不规则,结构紧凑,降解过程中逐渐变得蓬松和松散,呈絮状。另外,降解过程中少量WEAX被降解为聚合度为2~6的AXOS,但未产生单糖。降解速率在前3.5h最高。(4)纯化β-1,4-木聚糖内切酶对小麦源WUAX也有降解作用。经过6h的降解,反应溶液中的WEAX由原来存在的1.41μg/mL增加到13.56μg/mL。随着降解时间的延长,产生了含量相对较高的AXOS,并推测该酶对寡糖也存在降解作用。酶解产物中WEAX的分子量在23~27kDa之间。反应2h后,降解产物的粘度升高比较明显,粘度为1.06mPa?s,随后随着降解时间的增加反应溶液的粘度又下降。随着剪切力的增加WEAX溶液的粘度在下降,并在30s~(-1)以后的剪切速率条件下几乎保持不变,说明WEAX溶液是一种假塑性流体。降解速率在前2h最高。


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