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玉米纹枯病菌(Rhizoctonia solani)多糖单加氧酶RsPMO159激发活性关键区段及位点的研究

张圆圆  
【摘要】:玉米(Zea mays L.)是重要的粮食作物与工业原料,在我国广泛种植。玉米纹枯病是玉米的一种高发性土传病害,严重影响玉米的产量与质量。立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)AG-1-IA融合群是玉米纹枯病的主要优势致病菌群。植物细胞壁是植物抵御外来病原菌侵染的第一道防线,病原菌在侵染过程中会分泌一系列的植物细胞壁降解酶(PCWDEs),用于降解植物细胞壁中的纤维素等多糖成分从而完成侵染目的。目前,植物细胞壁降解酶中的果胶酶、木聚糖酶、纤维素酶和角质酶已经被证实具有独立于其酶催化活性的PAMP活性。纤维素是植物细胞壁的重要组成部分,降解纤维素需要内切纤维素酶、外切纤维素酶以及β-葡萄糖苷酶以及其他辅助活性酶等共同完成。多糖单加氧酶PMOs是一种依赖铜离子的辅助活性酶,可以通过氧化断裂纤维素中的糖苷键,提高典型纤维素酶的水解能力,成熟肽第一位组氨酸是其结合铜离子的关键位点,在CAZY(Carbohydrate-Active Enzymes Database,碳水化合物活性酶数据库)中归属于辅助活性酶AA9家族。目前国内外对于PMOs的研究主要集中在其氧化方式与氧化产物鉴定等方面,对于大量来自病原菌AA9家族中的PMOs的PAMP功能研究还未见报道。本研究中,以玉米纹枯病主要优势致病菌群—立枯丝核菌AG-1-IA融合群为研究材料,其产生的PMOs多糖单加氧酶为研究对象。通过对CAZY数据库中立枯丝核菌的AA9基因进行扩增,成功获得了RsPMO159、Rs PMO231和Rs PMO289三个多糖单加氧酶基因。通过农杆菌介导法浸润本氏烟进行瞬时表达,发现RsPMO159能够引起烟草叶片过敏性坏死,从而对RsPMO159展开下一步研究。RsPMO159含有249个氨基酸,1-19位氨基酸为信号肽序列,属于辅助活性酶AA9家族。通过基因定点突变将RsPMO159成熟肽第一位组氨酸(H)突变为丙氨酸(A),导致其失去酶催化活性,获得失活突变体H1A。将H1A通过农杆菌介导法进行烟草瞬时表达,结果显示H1A仍可以引起烟草叶片的过敏性坏死反应。证明RsPMO159可以不依赖其降解纤维素的酶活性引起烟草叶片组织的坏死,可能是一个新的PAMP分子,并对其激发活性的机制及PAMP活性展开研究。以多糖单加氧酶RsPMO159为研究对象,将H1A从C端进行不同大小区域连续截断并进行烟草瞬时表达,最终将激发活性关键区段确定为RsPMO159的第175至180位氨基酸。以H1A为基础,通过对激发活性关键区段单个氨基酸和双位氨基酸的定点突变并进行烟草瞬时表达,初步确定激发活性位点由第177与178位氨基酸共同组成。之后对RsPMO159野生型第177与178位氨基酸进行双位氨基酸定点突变,获得激发活性位点突变体RsPMO159-G177A/L178A烟草瞬时表达,结果显示RsPMO159-G177A/L178A不能引起烟草的过敏性坏死反应。最终确定激发活性位点为第177与178位氨基酸共同组成。活性氧染色结果证明RsPMO159及H1A可以引起活性氧的迸发,RsPMO159-G177A/L178A不能诱导烟草叶片活性氧的产生,进一步确定了RsPMO159的激发活性位点和PAMP活性。本研究推断RsPMO159可能是一个PAMP分子,且其PAMP功能与其酶催化活性相互独立,RsPMO159激发活性关键区域是第175至180位氨基酸,激发活性位点由第177与178位氨基酸共同组成。


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