奶牛乳腺炎中金黄色葡萄球菌耐药性分析及噬菌体的分离鉴定与应用

【摘要】：奶牛乳腺炎是奶牛养殖业中常见的多发性疾病,不仅给奶牛业带来严重的经济损失,同时也给人类健康带来潜在的威胁。奶牛乳腺炎通常是由一种或多种非特定的病原微生物感染所致,其中金黄色葡萄球菌是最主要的病原菌之一。金黄色葡萄球菌极易产生耐药性,而且它感染的奶牛乳腺炎常表现为亚临床症状,具有难防难控的特点。抗生素是奶牛乳腺炎治疗的首要选择,但随着细菌耐药性的不断增强,治疗效果并不理想。同时抗生素在牛奶中残留进一步加重了奶牛养殖业的经济损失。噬菌体是一类能特异性裂解细菌的病毒,作为生物抑菌剂具有高效安全的优点。本研究通过对乳腺炎奶样中病原菌分离,分析奶牛乳腺炎中金黄色葡萄球菌的感染情况与耐药性。并以临床分离的金黄色葡萄球菌作为宿主菌分离噬菌体,通过形态观察和基因组测序,从结构和基因两方面结合对其进行分类。同时分析噬菌体的生物学特性和抗逆性,进一步为研究提供基础数据。探究噬菌体对生物膜的作用,可为其开发细菌环境抑制药物提供理论基础。最后建立金黄色葡萄球菌乳腺炎小鼠模型,并使用噬菌体进行治疗,探究噬菌体在体内对细菌感染的治疗效果,可为金黄色葡萄球菌感染的治疗提供新思路。2020年从全国不同地区37家规模化奶牛养殖场中送检的408份临床乳腺炎奶样中,共分离到病原菌215株,其中金黄色葡萄球菌19株(8.84%)。通过纸片扩散法对本实验分离得到和实验室之前保藏的共37株金黄色葡萄球菌进行耐药性试验。结果显示金黄色葡萄球菌对氨苄西林、红霉素和诺氟沙星的耐药性较强,对四环素、庆大霉素表现敏感,有19株金黄色葡萄球菌表现出多重耐药性。利用双层平板法从奶牛场周边污水中分离出3株噬菌体,分别命名为SP107、SP688和SP160。通过透射电镜观察,3株噬菌体均具有长且不可收缩的尾巴,属尾状噬菌体目,长尾噬菌体科。对其生物学特性(裂解谱、最佳感染复数、裂解动力学)及抗性(温度、p H及紫外线的稳定性)进行探究。SP107、SP688可裂解9株金黄色葡萄球菌,SP160仅能裂解其宿主菌。最佳感染复数分别为0.1、1和1,000。裂解动力学结果表明3株噬菌体均可抑制细菌生长。3株噬菌体均在-20℃到54℃范围活性稳定,在p H值3～11之间活性稳定,对紫外线敏感。利用Illumina Genome Analyzer测序技术对3株噬菌体进行全基因组测序,使用Gene Mark S对基因组进行编码基因预测。结果显示噬菌体SP107、SP688和SP160均为环状DNA,全基因组长度分别为44,644 kb、45,499 kb、42,790 kb,GC含量分别为33.92%、34.44%、34.10%。SP107和SP688基因组中已知功能的ORFs注释结果相同,均不含毒力基因,具有应用安全性。SP160基因组中有两段编码裂解酶和一段水解酶的不同序列,含有毒力基因。综合噬菌体生物学特性及应用安全性,选择SP107噬菌体进行应用性探究。采用结晶紫染色法探究噬菌体在体外对金黄色葡萄球菌生物膜的清除能力,结果表明,SP107对其裂解谱中4株金黄色葡萄球菌生物膜均有清除作用。利用金黄色葡萄球菌107成功构建了小鼠乳腺炎模型,确定10~7CFU/50μL为最佳攻菌浓度。通过临床与解剖学观察、组织病理学切片观察和检测组织细菌量的方法,探究噬菌体SP107对小鼠乳腺炎模型的治疗效果,结果显示通过清除乳腺组织内的细菌,有效减少了乳腺组织内细菌数量,减轻了炎症反应带来的病理损伤,有利于乳腺组织的自我修复进程。综上,本实验从生产中获得耐药性金黄色葡萄球菌,并以它们为宿主分离得到3株噬菌体;对其生物学特性和全基因组序列做了分析,为其应用提供了数据支持;通过分析噬菌体在体外对金黄色葡萄球菌生物膜的清除作用,并应用其对小鼠乳腺炎模型进行治疗,为金黄色葡萄球菌耐药菌株感染的治疗奠定了基础。