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复合益生菌对家兔肠道菌系及健康的作用效果研究

侯晓红  
【摘要】:益生菌在动物生产中已经得到了广泛应用,在“禁抗”时代,益生菌由于具有诸多优点,已经成为绿色饲料添加剂行业研究的新方向。为了更好的评估益生菌在生产中的潜力,本研究通过检测益生菌的产酶能力,耐受人工胃液、肠液的能力,黏附能力及抑制出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli,EHEC)黏附Caco-2细胞的能力对益生菌进行筛选。将筛选出的具有优良性能的菌株进行组合,通过体外和体内试验,研究复合益生菌在感染EHEC的RK-13细胞及家兔机体中发挥的作用。为验证复合益生菌在动物体内产生的益生效果,本研究进行了家兔饲喂试验,评估了复合益生菌对家兔生长性能、免疫能力、抗氧化能力及肠道屏障功能的影响,并通过宏基因组学方法研究复合益生菌对家兔盲肠菌群的种类及丰度、功能通路及抗性基因的影响。本研究主要分为以下三个部分:1.益生菌的筛选及组合本研究首先评估了11株乳酸菌的产蛋白酶能力,结果表明乳酸乳球菌6242,嗜酸乳杆菌6075以及植物乳杆菌21790具有较高的产酶能力。通过对乳酸菌耐受人工胃液、肠液的能力进行检测发现乳酸乳球菌6242,植物乳杆菌21809、21790和屎肠球菌24203可以在通过胃液时保持较高存活率,存活率均超过40%。鼠李糖乳杆菌6141、6137,嗜酸乳杆菌6075,植物乳杆菌21790和屎肠球菌24203可以在肠液中保持较高活力,存活率均超过60%。另外对乳酸菌的黏附能力进行检测发现,乳酸乳球菌6242和德氏乳杆菌保加利亚亚种6103在所有受试菌株中黏附力较强。随后研究了乳酸菌抑制EHEC黏附Caco-2细胞的能力,结果发现,乳酸乳球菌6242,植物乳杆菌21790及嗜酸乳杆菌6075在所有受试菌株中对EHEC黏附Caco-2细胞的抑制率最高。综合产酶能力,耐受人工胃液、肠液能力,黏附力,以及抑制EHEC黏附Caco-2细胞的能力,筛选出四株性能较好的乳酸菌,分别是乳酸乳球菌6242,植物乳杆菌21709,嗜酸乳杆菌6075及屎肠球菌24203。将筛选出的乳酸菌与凝结芽孢杆菌24625,枯草芽孢杆菌BYS2,酿酒酵母33298,丁酸梭菌10390进行组合,分为乳酸菌组(6242、21709、6075、24203)以及复合益生菌组(24625、BYS2、21790、33298、10390)进行后续试验。2.复合益生菌对家兔生长性能、抗氧化能力、肠道菌群及免疫力的影响为了检验复合益生菌对家兔生长性能、抗氧化能力、肠道屏障功能、肠道菌群以及免疫力的影响。本研究将300只新西兰大白兔随机分为四组:乳酸菌组(A组)、复合益生菌组(B组)、对照组(C组)、抗生素组(D组)进行饲喂试验。通过对家兔血清免疫球蛋白含量以及免疫器官指数进行检测发现,B组免疫器官指数以及血清免疫球蛋白Ig G、Ig M含量显著提高(P0.05),表明益生菌可以提高机体免疫能力。通过对家兔抗氧化能力进行检测发现,B组超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)含量与其他组相比显著升高(P0.05),过氧化氢酶(Catalase,CAT)含量在A组中显著升高(P0.05),B组丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量显著降低(P0.05),这说明饲喂益生菌在一定程度上可以增强机体的抗氧化能力。在第五周,采取家兔盲肠内容物进行宏基因组测序,发现饲喂益生菌提高了盲肠菌群中Ruminococcus、Akkermansia的相对丰度,降低了Alistipes、Bacteroides的相对丰度。通过线性判别分析(Linear discriminant analysis effect size,LEf Se)发现在C组中关键的OTUs主要为Euryarchaeota分类下的Methanobacteria,在A和B组中关键的OTUs主要为Firmicutes下的细菌及真菌,D组中关键的OTUs主要为Proteobacteria,这表明饲喂益生菌显著影响了盲肠内的微生物组成。对测序结果与京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)数据库进行比对发现B组主要的KEGG通路为氨基酸代谢通路、脂质代谢通路、异生物质的降解与代谢通路和碳水化合物代谢通路。A组的KEGG通路主要集中为辅助因子及维他命代谢通路、聚糖的生物合成与代谢通路、萜类化合物和聚酮化合物的代谢通路、脂质代谢通路。D组的KEGG通路主要为其它次级产物的生物合成通路、萜类化合物和聚酮化合物的代谢通路。另外,本研究发现家兔盲肠内抗生素耐药本体(Antibiotic resistance ontology,ARO)基因主要为β-内酰胺酶类(OXA-257、CTX-M-106、LEN-12、LRA-12),超广谱β-内酰胺酶类(TEM-147、TEM-16),大环内酯2'-磷酸转移酶II(MPHB),质粒介导的喹诺酮抗性蛋白(QNRB33),氨基糖苷磷酸转移酶(APH(3')-VIIIa),糖肽类抗生素(VANTG)。其中B组ARO基因种类有1964种,而D组最多达到2105种,A、C组有1982种,这反映了益生菌在一定程度上可以减少家兔肠道内的抗生素耐药基因的产生。本研究对家兔生长性能进行了检测,结果表明,与C组相比,B组平均体重提高了14.88%,A组平均体重提高了12.33%,说明日粮中添加益生菌可以显著提高家兔的生长性能(P0.05)。3.复合益生菌对感染EHEC的RK-13细胞及家兔的影响对感染EHEC的RK-13细胞中细胞因子的表达情况进行检测发现,复合益生菌可以显著降低感染EHEC的RK-13细胞中炎性细胞因子m RNA的表达量(P0.05)。与EHEC组相比,B组DEFB124的表达量显著升高(P0.05),这说明益生菌可以抑制EHEC引起的炎性反应,同时可以增强防御素的表达。另外,本研究对家兔感染EHEC后的存活情况进行统计发现,与C组相比,A组家兔存活率提高了23.51%,B组存活率提高了34%。攻毒3天后对家兔脾脏细胞因子表达情况进行检测发现A组、B组的IL-6表达量显著降低(P0.05),IL-4及防御素表达量显著升高(P0.05),这也与攻毒后益生菌组家兔存活率升高有关。通过体内、体外试验证明,益生菌可抑制由EHEC引起的机体内炎性细胞因子的产生,并能提高防御素的表达量,这有助于家兔发挥抗感染作用。综上所述,益生菌,尤其是不同种类的益生菌进行组合,可以提高家兔的生长性能、抗氧化能力、免疫能力及抗病力,改善肠道屏障功能,调节肠道菌群的种类、丰度及功能通路以对机体产生更好的益生效果,并且在一定程度上可以减少家兔肠道内的抗生素耐药基因的产生。本研究期望为复合益生菌作为绿色健康的饲料添加剂提供数据支持和理论参考。


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