收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

伪狂犬病病毒La株的分离鉴定和囊膜糖蛋白E基因的克隆及序列分析

刘文强  
【摘要】: 伪狂犬病病毒(PRV)是猪、牛等动物伪狂犬病的病原,尤其是猪最为易感。主要引起仔猪急性致死性感染,15日龄以内仔猪死亡率可达100%。大猪发病后可表现出不同的临床症状,包括脑炎、肺炎的症状,对其他呼吸道病原体的易感性增强等,并可造成免疫抑制,孕猪伴有流产,康复猪常呈潜伏性感染。尤其在种猪场,PRV可造成严重的经济损失。本研究对山东某发生疑似伪狂犬病的猪场分离到的一株PRV,进行了生物学特性鉴定,并对囊膜糖蛋白巨基因的进行了克隆和序列测定。病毒分离自一病死仔猪的小脑、脑干和延髓等组织。用其感染BHK-21细胞后产生了典型的细胞病变,连续传代23次,都产生了稳定一致的细胞病变。应用琼脂糖固体培养基筛选病毒蚀斑,得到了性状单一的病毒克隆株。病毒在BHK-21细胞上的TCID_(50)。为10~(7.46)/0.1ml。病毒对热、乙醚、氯仿和阳离子敏感,这些理化性质均符合疱疹病毒的特性。经中和试验,计算其中和指数为94.2,表明病毒能被阳性血清中和。另外,在电镜下观察到典型的伪狂犬病病毒粒子;用病毒感染细胞的上清液接种家兔和小白鼠,均出现典型的伪狂犬病症状。以上鉴定结果表明从该猪场分离到的是猪伪狂犬病病毒,按照惯例,我们将其命名为PRV La株。同时以分离病毒的DNA为模板,通过PCR技术扩增出gE基因片段,从病原水平和核酸水平进一步证实了所分离的病毒为PRV。 将第20代病毒接种RK细胞、Vero细胞、Marcl45、ST细胞和CEF细胞,都出现了典型的CPE。测定了PRV La在各种易感细胞上的毒力差异情况,发现PRV最易感染BHK-21和Marc145细胞,而对其它细胞的毒力差异不大。这可能与细胞本身的密度和对PRV的易感性有关。 本试验设计了一对特异性引物,以PRV La株感染BHK-21细胞后提取病毒基因组DNA作为模板,成功的扩增出La株1757bp的gE基因,其开放性阅读框长1740bp,共编码579个氨基酸。并且,利用此反应体系从新泰、枣庄和济宁等地分离到的伪狂犬病病毒感染的细胞中也扩增出了gE基因,配合其它诊断方法,对上述各猪场的伪狂犬病进行了确诊。对gE基因测序结果的分析表明,PRV La株gE基因与Ea株、SH株、Fa株、GD株和国外的Rice株碱基序列的同源性分别是99%、98.7%、98.4%、98.1%和97.4%:氨基酸序列的同源性分别为98.1%、97.4%、96.6%、96.4%和95.0%。表明gE基因的DNA序列和氨基酸序列变异不大,与整个疱疹病毒的保守性是一致的,但是其变异情况与地域分布有一定的关系,即距离山东越远的地区分离到的毒株,其gE基因的核苷酸序列氨基酸序列与La株的同源性越小。 选择了pEGFP-C1质粒作为载体,将gE基因克隆到pEGFP-C1中,可作为下一步的真核表达材料。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 李富强,刘尚高;伪狂犬病病毒北京株的纯化及电镜观察[J];中国兽医科技;1999年10期
2 陈陆,郭万柱,殷华平,查光明;伪狂犬病病毒基因缺失疫苗制苗用毒种特性研究[J];中国病毒学;2005年02期
3 仇华吉,童光志,周彦君,李昌文,钱平,孔令达;通用伪狂犬病病毒转移载体的构建[J];中国预防兽医学报;2000年S1期
4 郭万柱,D.Burger,D.T.Shen,谢跃,冯炳芳,余广海,汪铭书;伪狂犬病病毒基因组文库的构建及其糖蛋白基因的鉴定[J];病毒学报;1993年03期
5 阎高峰,李健强;抗伪狂犬病病毒单克隆抗体的特性鉴定[J];青海畜牧兽医杂志;1999年04期
6 李祥敏,钱平,石德时,金梅林,蓝盛银,陈焕春;哺乳仔猪中伪狂犬病病毒鄂A株对细胞凋亡的诱导或抑制[J];生物化学与生物物理学报;2003年04期
7 李树根;Peter Cowen;;使用限制性内切酶分析不同的伪狂犬病病毒株[J];中国预防兽医学报;1989年05期
8 丁建华,王家富,罗满林,付烈振,郑友限,雷亮,张楚瑜;伪狂犬病病毒HS株tk基因的PCR扩增与克隆[J];中国兽医学报;1998年02期
9 温荣辉,罗廷荣,余克伦,黄伟坚;两株广西伪狂犬病病毒的分离鉴定[J];广西农业生物科学;2000年03期
10 姜焱,汪海健,祁贤,叶向阳,陈溥言;伪狂犬病病毒上海株gE基因克隆及其含GFP基因质粒载体的构建[J];中国兽医科技;2001年10期
11 张传斌,颜其贵,郭万柱,欧洋;伪狂犬病病毒IE180基因的研究进展[J];中国动物保健;2005年11期
12 郭万柱,徐志文,王小玉,程陆,王印,汪铭书;新型伪狂犬病病毒基因缺失株的构建及生物学特性研究(初报)[J];四川农业大学学报;2000年01期
13 陈新华,杨林,洪文洲,陈焕春,陈曲侯,龙綮新,王珣章;伪狂犬病病毒鄂A株包膜糖蛋白gD基因的克隆与表达[J];微生物学报;2001年03期
14 陈新华,杨林,龙綮新,王章,陈曲侯,洪文洲,陈焕春;伪狂犬病病毒鄂A株囊膜蛋白gD基因在杆状病毒载体系统中的表达研究[J];生物化学与生物物理进展;2002年03期
15 金梅林,李祥敏,陈焕春,何启盖,吴斌,方六荣,吴美洲;伪狂犬病病毒感染诱导和抑制细胞凋亡[J];中国兽医学报;2002年03期
16 姜焱,侯玉峰,陈德胜,黄伟坚,范伟兴,陈溥言;伪狂犬病病毒上海株的gI基因的克隆和序列分析[J];动物医学进展;2002年02期
17 陈焕春,方六荣,何启盖,金梅林,索绪峰,吴美洲;猪伪狂犬病病毒鄂A株的分离鉴定[J];畜牧兽医学报;1998年02期
18 黄伟坚,温荣辉,秦爱珍,余克伦,梁家权,刘芳;猪伪狂犬病毒(PRV)桂B株的分离和鉴定[J];广西农业生物科学;1998年S1期
19 唐勇,陈焕春,肖少波,覃雅丽,何启盖,任裕其;伪狂犬病病毒gE基因主要抗原表位区在大肠杆菌中的表达与gE乳胶凝集鉴别诊断方法的建立[J];病毒学报;2002年02期
20 徐晓娟,徐高原,陈焕春,刘正飞,何启盖;伪狂犬病病毒TK~-/gG~-缺失株的构建及其生物学特性研究[J];生物工程学报;2004年04期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 赵凤云;张玉静;涂长春;欧阳红生;张永亮;刘思国;刘伯华;;PCR方法克隆伪狂犬病病毒立即早期蛋白IE180激活型基因突变体[A];新世纪 新机遇 新挑战——知识创新和高新技术产业发展(上册)[C];2001年
2 胡勤芹;马相如;陈焕春;;伪狂犬病病毒的结构蛋白与功能[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会成立20周年庆典暨第十次学术研讨会论文集(上)[C];2003年
3 崔保安;付元帅;张素梅;魏战勇;杨明凡;;金银花对伪狂犬病病毒体外抑制作用的实验研究[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会成立20周年庆典暨第十次学术研讨会论文集(上)[C];2003年
4 徐晓娟;徐高原;陈焕春;刘正飞;何启盖;;伪狂犬病病毒TK~-/gG~-缺失株的构建[A];中国畜牧兽医学会动物微生态学分会第三届第七次学术研讨会论文集[C];2004年
5 杨毅;李文刚;杨慧敏;吴高锋;饶宝;;猪伪狂犬病的诊断方法研究进展[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第七届全国会员代表大会暨第十三次学术研讨会论文集(上册)[C];2009年
6 李祥敏;钱平;金梅林;郭东春;徐卓菲;陈焕春;;口蹄疫病毒P1基因重组及伪狂犬病病毒TK~-/gG~-/PgG-P1的构建[A];全国首届动物生物技术学术研讨会论文集[C];2004年
7 李富强;张莉;刘尚高;王双山;靳玉芬;欧阳素贞;;伪狂犬病病毒北京株的纯化及电镜观察[A];猪的重要传染病防治研究新成果——中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第五届理事会第二次全体会议暨防检疫专业委员会第7次学术交流会论文集[C];2002年
8 赵凤云;涂长春;张玉静;欧阳红生;张永亮;刘思国;刘伯华;;伪狂犬病病毒基因缺失突变体的克隆与测序[A];中国生物化学与分子生物学会第八届会员代表大会暨全国学术会议论文摘要集[C];2001年
9 王时力;;无囊膜支撑的后房型人工晶体植入术3例报告[A];2011年浙江省眼科学术会议论文集[C];2011年
10 范锋;姚静;;成年奶牛感染伪狂犬病与流产之间相互关系的初步调查[A];中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会成立大会暨第一次学术研讨会论文集[C];2008年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 姜焱;伪狂犬病病毒上海株gE~-/gI~-/GFP~+/LacZ~+缺失株的构建及其免疫原性初步研究[D];南京农业大学;2002年
2 石谦;猪细小病毒-伪狂犬病重组病毒活疫苗SA215(B)的研究[D];四川农业大学;2005年
3 张焕容;伪狂犬病病毒、猪细小病毒和流行性乙型脑炎病毒检测基因芯片的构建及检测技术研究[D];四川农业大学;2005年
4 何启盖;猪伪狂犬病基因缺失疫苗研究[D];华中农业大学;2000年
5 阳爱国;伪狂犬病病毒主要毒力基因功能的研究[D];四川农业大学;2005年
6 李自力;猪乙型脑炎与伪狂犬病二价基因工程疫苗研究[D];华中农业大学;2004年
7 徐高原;猪乙型脑炎与伪狂犬病二价基因工程疫苗研究[D];华中农业大学;2005年
8 覃雅丽;猪伪狂犬病鉴别诊断方法的研究及单克隆抗体的制备[D];华中农业大学;2002年
9 袁子国;表达狂犬病病毒糖蛋白的重组伪狂犬病病毒的构建及免疫试验研究[D];吉林大学;2008年
10 徐静;乙型脑炎病毒—伪狂犬病病毒二联基因工程疫苗研究[D];四川农业大学;2008年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 刘文强;伪狂犬病病毒La株的分离鉴定和囊膜糖蛋白E基因的克隆及序列分析[D];山东农业大学;2002年
2 隋秀文;十种药物抗伪狂犬病病毒感染的实验研究[D];东北农业大学;2010年
3 蒋鹤春;伪狂犬病病毒gE基因的表达及初步应用[D];南京农业大学;2002年
4 熊符;伪狂犬病病毒鄂A株EP0基因的克隆、表达及转移载体pUSKVP_2的构建[D];华中农业大学;2001年
5 田志军;伪狂犬病病毒gE/TK基因缺失突变株的构建[D];东北农业大学;2003年
6 马相如;伪狂犬病病毒宿主关闭蛋白的基因克隆、表达及其结构分析[D];华中农业大学;2004年
7 覃广胜;伪狂犬病病毒广西B、W株gE基因的扩增、克隆及序列分析[D];广西大学;2002年
8 赵世广;分泌抗伪狂犬病病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及初步应用[D];河南农业大学;2002年
9 徐引弟;伪狂犬病病毒鄂A株BamHI5'片段gK、UL54、ORF-1基因的克隆与表达[D];华中农业大学;2001年
10 郑小坚;猪瘟病毒囊膜糖蛋白E_2基因融合表达载体的构建及初步表达[D];苏州大学;2003年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 王道坤;几类兽用新疫苗[N];中国畜牧兽医报;2006年
2 邢台市兽医院 邢兰君;仔猪伪狂犬病的诊治要点[N];河北农民报;2007年
3 记者 黄凤;想到对社会有所贡献就高兴[N];雅安日报;2007年
4 江南烟雨;病毒是啥样子[N];大众卫生报;2005年
5 赵惠芹;猪高热病的预防和控制[N];中国畜牧兽医报;2006年
6 王道坤;当前养猪谨防几个热点病[N];中国畜牧兽医报;2006年
7 山西省临汾市瑶都区畜牧兽医局 杜青林刘延春;猪伪狂犬病的综合诊治方案[N];中国畜牧兽医报;2008年
8 董以爱;开产蛋鸡传染性喉气管炎的诊治[N];中国畜牧兽医报;2005年
9 本报记者;国外七种常见的猪病[N];山东科技报;2006年
10 周彬;严防高致病性猪蓝耳病[N];中国畜牧兽医报;2007年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978