伪狂犬病病毒La株的分离鉴定和囊膜糖蛋白E基因的克隆及序列分析

【摘要】： 伪狂犬病病毒(PRV)是猪、牛等动物伪狂犬病的病原，尤其是猪最为易感。主要引起仔猪急性致死性感染，15日龄以内仔猪死亡率可达100％。大猪发病后可表现出不同的临床症状，包括脑炎、肺炎的症状，对其他呼吸道病原体的易感性增强等，并可造成免疫抑制，孕猪伴有流产，康复猪常呈潜伏性感染。尤其在种猪场，PRV可造成严重的经济损失。本研究对山东某发生疑似伪狂犬病的猪场分离到的一株PRV，进行了生物学特性鉴定，并对囊膜糖蛋白巨基因的进行了克隆和序列测定。病毒分离自一病死仔猪的小脑、脑干和延髓等组织。用其感染BHK-21细胞后产生了典型的细胞病变，连续传代23次，都产生了稳定一致的细胞病变。应用琼脂糖固体培养基筛选病毒蚀斑，得到了性状单一的病毒克隆株。病毒在BHK-21细胞上的TCID_(50)。为10~(7.46)/0.1ml。病毒对热、乙醚、氯仿和阳离子敏感，这些理化性质均符合疱疹病毒的特性。经中和试验，计算其中和指数为94.2，表明病毒能被阳性血清中和。另外，在电镜下观察到典型的伪狂犬病病毒粒子；用病毒感染细胞的上清液接种家兔和小白鼠，均出现典型的伪狂犬病症状。以上鉴定结果表明从该猪场分离到的是猪伪狂犬病病毒，按照惯例，我们将其命名为PRV La株。同时以分离病毒的DNA为模板，通过PCR技术扩增出gE基因片段，从病原水平和核酸水平进一步证实了所分离的病毒为PRV。 将第20代病毒接种RK细胞、Vero细胞、Marcl45、ST细胞和CEF细胞，都出现了典型的CPE。测定了PRV La在各种易感细胞上的毒力差异情况，发现PRV最易感染BHK-21和Marc145细胞，而对其它细胞的毒力差异不大。这可能与细胞本身的密度和对PRV的易感性有关。 本试验设计了一对特异性引物，以PRV La株感染BHK-21细胞后提取病毒基因组DNA作为模板，成功的扩增出La株1757bp的gE基因，其开放性阅读框长1740bp，共编码579个氨基酸。并且，利用此反应体系从新泰、枣庄和济宁等地分离到的伪狂犬病病毒感染的细胞中也扩增出了gE基因，配合其它诊断方法，对上述各猪场的伪狂犬病进行了确诊。对gE基因测序结果的分析表明，PRV La株gE基因与Ea株、SH株、Fa株、GD株和国外的Rice株碱基序列的同源性分别是99％、98.7％、98.4％、98.1％和97.4％：氨基酸序列的同源性分别为98.1％、97.4％、96.6％、96.4％和95.0％。表明gE基因的DNA序列和氨基酸序列变异不大，与整个疱疹病毒的保守性是一致的，但是其变异情况与地域分布有一定的关系，即距离山东越远的地区分离到的毒株，其gE基因的核苷酸序列氨基酸序列与La株的同源性越小。 选择了pEGFP-C1质粒作为载体，将gE基因克隆到pEGFP-C1中，可作为下一步的真核表达材料。