羊绿脓杆菌及其主要致病因子研究

【摘要】： 随着我国养羊业集约化的不断扩大，羊群疾病发生的种类在不断增加，近年来羊的一种慢性肺炎就是由规模化饲养以后出现的一种新疾病。该病主要表现为咳嗽，呼吸困难，慢性消瘦，后期发生死亡，给规模化养羊场造成了巨大损失，对养羊业造成了严重威胁。通过流行病学调查和病原检测，探明了导致该病的病原体为绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)。 本研究在确定绿脓杆菌是羊慢性肺炎致病菌的基础上，重点对该菌最主要致病因子外毒素A进行系统研究，从而为研究该病的发病机制和控制措施提供理论依据。本课题分四部分进行研究。 第一部分：羊绿脓杆菌的分离、鉴定 采用微生物学方法，对山东省某集约化羊场发生的一种慢性肺炎进行了系统的病原学研究。通过分离培养、显微镜检查，发现引起该病的病原体为一种革兰氏阴性小杆菌，此菌无芽胞、无荚膜，有鞭毛，可产生水溶性的蓝绿色色素，再结合生化试验等指标最终鉴定该菌为铜绿假单胞菌。用24h细菌培养物分别腹腔接种3日龄雏鸡(0.1ml／只)、10日龄鸡胚(0.1ml／只)、小白鼠(0.1ml／只)和成年家兔(0.3ml／只)，均于24h内死亡。用该菌接种健康羊，复制出了与自然发病羊相同的病状，并从死亡试验动物和人工发病死亡的羊体内回收到了接种的病原体。 第二部分：平板凝集抗原的制备及羊慢性肺炎的血清学调查 用分离纯化病原菌制成平板凝集诊断原，经稳定性试验、无菌试验、自凝和交叉凝集试验结果证明，自制的平板凝集诊断原性质稳定结果可靠。利用该诊断抗原，自2001年11月至2002年5月，从山东省泰安、菏泽、济宁、聊城、潍坊、济南、日照、莱芜等地(市)的养羊场/户共抽检羊246只，用平板凝集试验检测羊血清中抗PA抗体。结果发现，阳性率为94.7％。临床健康羊群抗体平均滴度为2.23log2，其中具有临床症状羊只体内抗体平均滴度为3.001og2。统计分析表明，除泰安羊的抗体滴度显著高于菏泽、潍坊、日照、济南的羊抗体滴度之外，泰安与其他地区及其他地区之间的羊抗体平均滴度差异不显著。在调查的全部羊群中，均存在该病的感染。 第三部分：绿脓杆菌外毒素A研究 以TSB(Tryptic Soy Broth)透析液作为基础，加入0.05M谷氨酸钠和1％甘油，于32℃震荡培养22h为产毒条件。4℃10000r／min离心30min，收集培养上清液。培养上清液分别用30％饱和硫酸铵去除杂蛋白、60％饱和硫酸铵粗提外毒素。然后用流水透析除盐，过DEAE柱和Sephedex G-200纯化。用分光光度法测浓度为0.857mg／ml。用环状沉淀试验初步检测为阳性，用SDS-PAGE进一步检测，结果显示出了分子量为66KD的一条蛋白带，与报道的标准毒株外毒素A大小相一致。将提出的外毒素A接种BALB／C小鼠(接种0.8ml／只)无致病性，但用PA4倍浓缩的上清液(0.2ml／只)则可致死小白鼠，这可能与提取过程中毒性丧失等因素有关，但用纯化的毒素免疫家兔，结果获得了滴度为10log2的高水平抗体。说明外毒素A具有良好的免疫原性。分别以外毒素A作为抗原和自制兔抗PEA阳性血清为抗体，建立了ELISA(夹心法)检测羊血清中抗PEA抗体的方法。该法灵敏度高，特异性强，适于大规模羊场的检疫。 第四部分：外毒素AⅢ区基因的克隆及序列分析 利用PCR技术，以绿脓杆菌 李雅林：羊绿脓杆菌及其主要致病因子研究 （暂命名为叩－SD－l株）的染色体DNA为模板，成功扩增出了该菌主要致病基因（绿 脓杆菌外毒素 A）111区基因。将该 PCR扩增片段与 yGE旷－T Eass载体连接，获得 了插入目的片段的重组质粒（命名为 PA－SD－ETA）。序列测定结果表明，该菌株与已 报道的其他绿脓杆菌菌株有较高的同源性（同源性大于 96．8％）o 与标准株 PA103 有97．7％的同源性，并出现单个碱基的点突变。