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烟草MARs序列的克隆、功能研究及其在杨树中的应用

王健美  
【摘要】: 在转基因植物的研究中,常常出现转基因沉默现象,又叫转基因失活,这种现象对于植物基因工程的应用与作物改良是一大障碍。过去,人们常常通过去甲基化或改变启动子等方式试图缓解这一现象的发生,但效果甚微。近年,MARs序列的发现及功能研究为克服转基因沉默、培育外源基因高效表达的转基因工程农作物提供了一条有效的途径。本试验通过PCR方法从烟草基因组中分离出三段MARs序列,并对其序列特征及其功能进行了分析研究,从中筛选出具有明显降低转基因沉默功能的强MARS序列,并将其应用于杨树基因工程育种。具体试验结果如下: 1.根据MARs序列的特征设计了两对引物,以烟草基因组DNA为模板进行PCR,得到了三段MARs序列,分别命名为TM1(1165bp)、TM2(1002bp)和TM3(475bp)。将这三段MARS序列与GenBank中的所有MARs序列进行DNA同源性比较,发现TM1与Rb7同源性高达99%,故认为二者是同一段MARs序列。而在GenBank中未发现TM2和TM3的同源性序列,将其作为两个新MARs序列在GenBank中注册,注册号码分别为:AF373415和AF373413。 2.序列分析表明,TM1、TM2和TM3富含AT序列,并且具有几个MARS序列中常见的DNA结构域,如:A-box、T-box、TATAAA、拓扑异构酶Ⅱ识别切割序列、DNA解旋序列等。 3.将TM1、TM2和TM3分别以顺式重复方向插入到pBI121的T-DNA结构域中,使MARs序列位于CaMV35S启动子控制的GUS基因两翼,构建了植物表达载体pBITMIGUSTM1、pBITM2GUSTM2和pBITM3GUSTM3,两段MARs序列之间的距离为2.9kb。 4.将上述三个表达载体与不包含MARs序列的pBI121表达载体经农杆菌介导转化烟草,分别获得了24株、28株、15株和22株转基因烟草,PCR结果显示,MARs序列已经整合到其基因组中。 5.对获得的转基因烟草叶片进行GUS活性定量测定,发现这三段MARs序列均能不同程度地提高GUS基因的整体表达水平。与不包含MARs序列的转基因植株相比,TM1、TM2和TM3分别使GUS基因的平均表达水平提高了1.4倍、5.1倍和1.3倍;使转化群体中最高单株GUS基因表达水平分别提高了1.7倍、7.4倍和2.2倍。但是此三段MARs序列均未能降低由位置效应引起的各转化体之间的转基因表达差异。将pBITM2GUSTM2高效表达载体申请了专利。 6.组织化学染色分析表明,MARs序列对外源GUS基因的瞬时表达无影响。 7.从大豆中克隆得到抗真菌病害的几丁质酶基因,将其构建到高效表达载体pBITM2GUSTM2中替代GUS基因得到表达载体pBITM2chiTM2,将其与对照表达载体pBIchi分别经农杆菌介导转化杨树,目前已建立了杨树再生体系并获得抗性芽。


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