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草莓离体再生及抗病基因遗传转化的研究

王海波  
【摘要】: 本研究以草莓品种丰香、矮丰、莱斯特和北斗为试材,研究了品种、激素配比、培养基、外植体、苗龄和培养条件对草莓不定芽再生的影响,优化了草莓再生条件,获得了草莓高效再生体系。通过叶盘与农杆菌共培养的方法建立了矮丰草莓的遗传转化体系,将抗真菌γ-硫堇蛋白(γ-thionin)Rs-AFP_1基因导入矮丰草莓叶片外植体,获得了Kanamycin抗性植株。GUS化学组织染色和PCR检测分析表明外源基因已整合到草莓基因组中。 再生实验结果表明,矮丰草莓的再生能力明显高于其它3个品种。培养基组成和激素配比直接影响草莓再生,MS(无机成分)+B_5(有机成分)培养基与MS、N_6和WPM培养基相比,可得到较高的不定芽再生率,在MS无机成分+B_5有机成分+TDZ 2.0mg/L+IBA 0.1mg╱L的培养基上再生率达97.5%。蔗糖、琼脂浓度和pH值也对草莓再生有显著影响,以蔗糖3%(W/V),琼脂0.75%(W/V),pH5.8为最佳培养基条件。以BA代替TDZ后,不定芽再生率没有显著变化,但再生不定芽长势减弱。暗处理和苗龄都影响草莓的再生,以35~40天苗龄,暗处理7天为最佳培养条件。用矮丰草莓叶片和叶柄进行不定芽再生实验,发现叶片再生频率明显高于叶柄,叶片接触培养基的方式对再生没有显著影响。再生芽可在MS+BA0.2mg╱L+IBA 0.1mg╱L的培养基上生根。 在建立矮丰叶片不定芽再生体系的基础上,利用农杆菌介导的遗传转化法进行矮丰遗传转化研究。结果表明,预培养降低GUS的瞬时表达量;菌液浓度在OD_(550nm)=0.3~0.5之间GUS瞬时表达量最大,侵染时间以30~60分钟为宜,共培养3天,IBA和AS的存在可以提高GUS瞬时表达量。共培养中Kan浓度过高不利于不定芽的分化,20mg/L的Kan可有效地抑制非转化芽的再生。Carb对不定芽再生无明显影响,试验中以300mg/L的Carb作为农杆菌生长的抑制剂。经Kan筛选,GUS组织化学染色和PCR检测证明共得到3个转基因株系。


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