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中国冬小麦主产区及云南丝核菌属真菌的遗传多样性研究

于金凤  
【摘要】: 丝核菌属(Rhizoctonia DC)真菌属半知菌门的丝孢纲(Hyphomycetes),无孢目(Agonomycetales),有性阶段为Ceratobasidium、Thanatephorus等担子菌的属,甚至与子囊菌(Ascorhizoctonia)有关。其遗传分化与遗传多样性非常丰富,在无性阶段、有性阶段、在致病力及形态特征等方面都存在较大差异。通常以菌丝和菌核的形态习居于土壤,能引起多种植物病害,因此丝核菌属真菌的研究受到国内外许多学者的关注。丝核菌属真菌特殊的形态特征使其种间的区分和鉴定相当困难,70年代提出的菌丝融合群分类法是当前对该属真菌最成功的分类手段,但它不能提供融合群间或亚群间及融合群内或亚群内更多的遗传分化及系统演化信息。分子生物学手段是检测包含丝核菌在内的真菌群体遗传变异规律的极其有用的工具。 本研究(1)利用RAPD DNA分子标记手段及rDNA-ITS序列分析方法对中国冬小麦主产区小麦纹枯病菌的遗传分化问题进行了探讨;(2)利用RAPD DNA分子标记手段对采集自云南不同生态区域,分属不同融合群的菌株的遗传多样性进行了检测;(3)利用RAPD DNA分子标记手段及rDNA-ITS序列分析方法对发生在玉米、水稻两种不同寄主上的AG1-IA群内菌株的遗传分化状况进行了探讨。弄清了所研究的丝核菌属真菌的遗传分化与菌株本身的致病力分化、寄主以及生态环境条件间的关系,为将来利用基因工程等分子手段来控制该类群真菌的发生及危害奠定了重要的理论基础。主要研究结果如下: 1. 将采自山东境内的55个小麦纹枯病菌菌株,按地区筛选出37个菌株进行苗期致病性的测定。根据不同菌株在三个测试的小麦品种上平均病情指数的大小,即致病力的大小利用UPGMA法将将供试的37个菌株分为强致病组(包含4个菌株)、较强致病组(7个菌株)、中等致病组(18个菌株)和弱致病组(8个菌株)四种类型,表明山东小麦纹枯病菌的致病力存在明显的分化。 2. 利用RAPD DNA分子标记手段对已进行了致病性测定的36个菌株的遗传多样性进行了研究。选用15个随机引物对供试菌株进行RAPD 扩增,共获得171个RAPD标记,其中多态性标记161个,占94.15%。利用UPGMA法构建的分子系统树可以看出:遗传距离0.33,可将受试菌株分为4个RAPD组,WK-6、WK-37和WK-13都是单菌株群,其余33个菌株构成一组,它们都属于AG-D成员,进一步的分析发现:遗传距离0.25,可将33个AG-D群菌株再分为7个RAPD组。说明受试的小麦纹枯病菌株间存在丰富的遗传多样性。且供试分离物的RAPD分组与菌株致病力的大小无明显的相关性。 将采自河北、安徽、河南、陕西、江苏、山东等中国冬小麦主产省份的37小麦纹枯病菌代表性菌株进行RAPD分析结果表明:遗传距离为0.3时,受试的37个菌株 WP=12 3. 被分为3个RAPD 组,其中最大组的菌株均为AG-D融合群的成员,另外两个组分别包括两个和一个菌株,由于它们和和标准菌株AG-D的遗传距离比较远,其归属有待于进一步鉴定。对属于AG-D的成员进一步分析发现,来自不同省份的小麦纹枯菌株的大多数都具区域相似性,来自河南、山东、河北、安徽及江苏的菌株关系更加密切,与来自陕西的菌株之间存在明显的遗传分化。说明小麦纹枯病AG-D融合群菌株的遗传分化与大区域的生态环境条件存在较密切的相关性。 4. 在对小麦纹枯病菌菌株进行RAPD 分析的基础上,从供试的72个菌株中有目的地选取21个菌株,对其5.8S rDNA-ITS区序列进行分析比较,并构建23个菌株分子系统发育树,由序列比较结果及所构建的分子系统发育树可以看出:引致小麦纹枯病的双核丝核菌其5.8S rDNA-ITS区序列的相似度在52.1%-99.8%的范围内,受试菌株被明显地分为3个不同的组。其中较大的组是AG-D(或CAG-1)群的成员,其5.8S rDNA及ITS1、ITS2区的核苷酸序列之间的相似度很高,相似度为97%-99.8%之间,不同菌株其ITS区序列共有26个位点发生了缺失、插入、突变等变异。根据其变异情况,以支持率大于500的分组作为有效分组判断指标,18个菌株又被分为5个聚类组。说明被测菌株的遗传多样性也能通过rDNA-ITS区的序列分析结果表现出来。但AG-D群不同菌株的分组尚未达到将其划分为不同亚群的水平。另外两个组分别各由3个菌株组成,与AG-D群菌株的相似系数为52.1%-54.2%。初步推断它们应是区别于AG-D群的另外融合群或亚群的菌株。 5. 利用12个随机引物对来自云南省不同地理环境的立枯丝核菌第一融合群的13个菌株进行遗传分化关系研究。结果表明:受试菌株被标记的DNA谱带多态性检测率为100%,受试的不同菌株间几乎无同质的DNA谱带,利用UPGMA法构建分子系统树分析发现,遗传距离0.5将其划分为9个RAPD组,遗传距离0.95将其划分为3个RAPD组,表明受试的AG1-IA融合群的13个菌株具有明显的遗传分化。 6. 利用RAPD分子标记手段对来自云南省不同地理环境的第四融合群和第六融合群的14个菌株进行遗传多样性分析,12个引物对供试的14个菌株共标记产生164条特异性的DNA谱带,多态性检测率为100%。UPGMA法构建的分子系统树分析发现:遗传距离0.41将供试的14个菌株分为两个RAPD组,第一组由属于AG-4 群的8个菌株构成,第二组由属于AG-6群的6个菌株构成。进一步的分析还发现,AG-4群的菌株


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