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小麦纹枯病菌产生的一种胞外蛋白酶及其致病机理的研究

赵蕾  
【摘要】: 小麦纹枯病是我国小麦的主要病害之一,近年来发病面积广,为害严重。为了深入阐明病害的发生机理,进一步揭示细胞壁降解酶在植物-病原互作中的作用,从而为病害的防治提供新的理论依据及防治手段,本文针对病原菌致病因子研究中的薄弱环节,对小麦纹枯病菌(Rhizoctonia cerealis Vander Hoeven)产生的胞外蛋白酶及其致病机理进行了研究,具体结果如下: 1. 从山东省各地采集到的小麦纹枯病病株上分离到19株小麦纹枯病菌分离系(isolates)。经Giemsa染色鉴定,细胞为双核,菌丝分枝接近直角,符合纹枯菌(Rhizoctonia cerealis Vander Hoeven)的特点。 2. X光片结果显示,小麦纹枯病菌(R. cerealis)在以小麦细胞壁为唯一碳氮源的诱导培养基中可产生多种蛋白酶。最佳产酶时间为48h。培养液经硫酸铵沉淀、SP-Sepharose Fast Flow 阳离子交换层析、Phenyl-Sepharose Fast Flow疏水层析、Sephadex G-75分子筛层析分离纯化到一种蛋白酶(RCP1)。经SDS-PAGE电泳银染后呈单带,分子量约为40 kD。 3. 用azocasein为底物测定了温度和pH对蛋白酶RCP1活性的影响。结果表明:RCP1的最适温度为37℃,最适pH值为8.0。在热稳定性方面,25℃以下保温60min后仍保持原有酶活力的90%。35℃以上酶失活速度加快,60min后酶活下降了55%,45℃以上处理60min酶活力基本丧失。在pH稳定性方面,以不同pH值,4℃处理1h显示,RCP1在pH6~10的范围内具有很高的稳定性,酶活力基本保持不变。金属离子Na+、Zn2+对酶活无影响,Mn2+、Mg2+对酶活有部分抑制作用,Cu2+、Fe2+、Pb2+对酶活有强烈的抑制作用,Ca2+在低浓度下对酶活有激活作用。 4.为进一步鉴定蛋白酶RCP1的性质,本研究进行了专一性底物和抑制剂特性试验。底物专一性测定显示,RCP1能水解胰蛋白酶专一性底物Benz-Phe-Val-Arg-NA,对D-Val-Leu-Arg-NA、Benz-Pro-Phe-Arg-NA和D-Val-Phe-Lys-NA也有活性,说明RCP1能降解Arg和Lys形成的酰胺键和肽键,具有类胰蛋白酶活性。RCP1对凝乳弹性蛋白酶底物Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-NA和枯草杆菌蛋白酶底物CBZ-Gly-Gly-Leu-NA无活性。抑制剂结果显示,RCP1能被胰蛋白酶抑制剂aprotinin 、leupeptin和soybean trypsin inhibitor强烈抑制,丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF能部分抑制酶的活性,表明其活性中心有Ser残基,半胱氨酸蛋白酶抑制剂iodoacetamide和天冬氨酸蛋白酶抑制剂pepstatin WP=9 对酶活无影响。以上结果表明,RCP1是丝氨酸蛋白酶中的一种类胰蛋白酶。 5. 在RCP1致病机理的研究方面,本研究用提取的小麦细胞壁作为底物,分别测定了酶作用后底物中的蛋白含量及产物中羟脯氨酸含量的变化。结果表明,酶作用后底物中的蛋白含量比对照减少了34.58%。产物中的羟脯氨酸含量明显增高,释放出的羟脯氨酸量是同时加入类胰蛋白酶抑制剂aprotinin处理的3.5倍,说明蛋白酶RCP1能够降解寄主小麦细胞壁。 6.为直接观察类胰蛋白酶RCP1对活体小麦组织超微结构的影响,本研究采用了将纯化的RCP1蛋白酶液注入到活体小麦叶片,25℃保温24h后进行电镜观察的新方法,与以往用酶液浸泡植物离体组织的方法相比,方法更为科学,既能保证酶液进入植物组织,又能保证电镜制片时的活体要求,所示结果更为可靠,为今后同类研究积累了经验。得到的植物病原真菌产生的蛋白酶对植物细胞壁及膜系统超微结构影响的电镜照片显示,处理的小麦组织细胞发生了一系列的病理变化,包括细胞壁部分消解、质膜、叶绿体膜被破坏等,说明病原菌在侵染过程中,RCP1参与了寄主细胞壁的降解。 7.用测定蛋白酶总酶活的底物azocasein和类胰蛋白酶的特异性底物Benz-Phe-Val-Arg-NA分别对受病菌侵染小麦和健康小麦体内的蛋白酶活性进行了检测。结果表明,受侵染小麦体内的蛋白酶活性在一定时期内随着发病症状的加重而增加。接菌后22天时,受侵染小麦体内的总蛋白酶活是对照的6倍,类胰蛋白酶活为对照的2倍,类胰蛋白酶抑制剂aprotinin 可抑制受侵染小麦体内类胰蛋白酶的活性,说明病原菌(R. cerealis)在小麦体内除了产生类胰蛋白酶RCP1外,也产生其它蛋白酶。 8.为了从分子水平上证明小麦纹枯病菌产生的类胰蛋白酶基因在植物中的表达,选用4个植物病原真菌中类胰蛋白酶的N末端最保守的一段序列作为上游引物,类胰蛋白酶的活性部位序列作为下游引物,通过RT-PCR扩增,从受侵染的小麦组织中扩增出了一条片段,而在健康植物中没有此片段,说明受侵染植物中增加的类胰蛋白酶活性来源于病原真菌,健康植物中的类胰蛋白酶与病原真菌产生的类胰蛋白酶不同。


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