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转甜菜碱醛脱氢酶基因葡萄品种的鉴定

刘建强  
【摘要】: 本试验于2001~2003年在山东农业大学园艺学院、山东省葡萄酿酒研究所、东营市林业局苗圃中进行,以转甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因的宝石无核葡萄和红球葡萄为试材,建立快繁体系,利用抗生素筛选、GUS基因染色以及PCR进行特定基因克隆等方法对转化效果进行鉴定,同时利用组织培养、盆栽和水培的方法对转基因葡萄的耐盐性和耐碱性进行研究,以及在生理、形态方面进行测定与观察,主要结果如下: 1.建立了转BADH基因宝石无核、红球葡萄的快繁体系。筛选出分化、伸长、生根的一系列培养基。分化培养基以B_5+6-BA0.4mg.1~(-1)为最佳,分化苗多、芽头密度高、叶色绿;伸长培养基以B_5+KT3.0mg.1~(-1)+NAA0.1mg.1~(-1)为最佳,苗子伸长现象明显、粗壮;生根培养基以B_5+IAA0.4mg.1~(-1)为最佳,7天后开始生根,生根数量多,粗壮;简化组培生根结果也表明,IAA效果好,苗子生长旺盛,侧根数目多,移栽易于成活。 2.转基因葡萄的鉴定: (1) 在分化培养基上,利用抗生素进行筛选,在含50mg.1~(-1)卡那霉素的条件下培养50天,转化植株生长较为正常,而对照大部分白化死亡。 (2) 利用GUS基因染色液进行染色,转化植株染成深蓝色而对照没变化。 (3) 对于经过卡那霉素初步筛选获得的宝石无核、红球葡萄转化植株利用PCR进行特定基因克隆。宝石无核共检测6株,有4株有约1.5Kb的特异带产生。红球共检测5株,有4株有约1.5Kb的特异带产生。对于经过检测获得的转化植株,进行再次检测,宝石无核和红球各取3株,都有约1.5Kb的特异带产生。对于红球转化植株进行BADH基因3'端克隆,检测5株,有两株有约300bp的特异带产生。同时对经过PCR检测获得的一株红球转化植株进行3'端和结构基因的克隆,有两条特异带产生。 3.在组织培养、盆栽和水培条件下,对转基因葡萄进行耐盐性和耐碱性鉴定,结果如下: (1) 在组织培养条件下,随着盐分梯度的提高,在分化培养基上,转基因葡萄的始分化天数逐渐延长,分化率、芽头密度逐渐降低,生长势逐渐减弱,死亡率逐渐升高,在5‰盐分梯度以下转基因葡萄生长表现正常,而对照只有在3‰盐分梯度以下生长表现较为正常。在生根培养基上,始生 刘建强;转甜菜碱醛脱氢酶基因葡萄品种的鉴定 根天数逐渐延长,I级根平均日变化,平均根条数逐渐降低,生长势逐渐 减弱,死亡率逐渐升高;生根培养叨天后,l级植株平均苗高和1级根 平均根长在总体上逐渐下降,叶绿素含量逐渐降低,在5%。盐分梯度以下 转基因葡萄生长表现较好。 (2) 在组织培养条件下,进行耐碱试验,结果表明:转基因葡萄在始分化 天数、芽头密度、死亡率、生根率、1级根平均日变化、l级植株平均苗 高以及生理形态指标等方面与对照差别不大,说明转基因葡萄耐碱性不明 显。·在所有的碱度之内转基因葡萄在各个指标的表现差异不明显,说明碱 胁迫不是盐碱地栽植困难的主要限制因子。 门)在盆栽条件下检测转基因葡萄的耐盐碱性差异,结果显示: 在盐碱土上,转基因葡萄可以在含盐量 5输时生长,而无明显的盐害 症状,生长势中等,在含盐量7%条件下转基因葡萄仍能够存活,但表现出 较为明显的盐害症状。在浇灌不同浓度NaCI的土壤上,转基因葡萄植株移 栽成活率为100人 在1%厂4%删aCL范围内均有不同程度的生长,在 5%ON沈L以上,转化植株生长不明显,叶缘白化。 (4)在水培条件下,转基因葡萄在4%。盐分梯度以下生长表现正常,在 5%。处理下表现出轻度的受害状,而对照只有在2%。处理下生长表现正常。 在不同盐处理浓度下,转基因葡萄开始出现盐害的时间存在差异。在1%0 处理下20天左右出现盐害症状,而在7%。条件下,只有6天就出现盐害 症状。在盐胁迫下,转基因葡萄的质膜透性发生不同程度的增加,5%。处 理下出现高峰,从6hi处理以上,质膜透性有较大幅度下降,在一定程度 表明转基因葡萄对盐的耐受性降低。随着盐分梯度的提高,转基因葡萄的 叶绿素含量逐渐下降,从4%0到5%叶绿素含量发生较大程度的下降。 4.对转基因葡萄和对照的各项生理指标进行测定,结果如下:· 对转基因宝石无核葡萄相对电导率和大分子渗漏值的测定结果表明 转化植株的相对电导率和大分子渗漏值与对照相比明显较低;对转基因红 球葡萄的测定结果亦是如此。对气孔密度的差异性分析表明,对照与转基 因葡萄之间在0.05水平上差异显著,在0.of水平上差异极显著,气孔数 量少,减少蒸腾作用,有助于在盐胁迫下的存活及生长。


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