SP启动子与内含子对转基因杨树中外源基因表达的影响

【摘要】： 杨树是世界主要的造林和经济树种，在中国和世界各地均有广泛的栽培。三倍体毛白杨杨以其生长快、抗性强,纤维长等优点,已成为目前营造人工速生丰产林的造林树种之一；且由于三倍体杨树的高度不育而只能进行无性繁殖，因此不存在转基因植物投放田间后外源基因污染其他植物的安全性问题，所以本研究选择BT-18号三倍体毛白杨作为转基因的实验材料，研究了激素浓度等因素对其叶片再生的影响，建立了离体叶片培养诱导植株高频再生的体系。 SP启动子来自于章鱼碱和甘露碱合成酶基因，并由人工拼接合成。研究报道，由SP启动子指导的烟草叶片组织中GUS基因的表达活性分别是CaMV 35S和双CaMV 35S启动子活性的156倍和26倍，并且SP启动子在根部具有很高的表达活性。本研究在BT-18号三倍体毛白杨高频再生体系的基础上，构建了表达载体，通过改良的农杆菌介导的转基因方法获得大量的转基因植株，并分析了SP超强启动子和CaMV35S启动子在BT-18号三倍体毛白杨中的表达活性以及内含子（intron）序列对外源基因表达的影响，为杨树转基因育种工作提供许多极有价值的实践和理论依据。具体实验结果如下： 1. 建立了BT-18号三倍体毛白杨离体叶片的高频再生体系,确立了最佳分化培养基（MS+0.5mg/L 6-BA+0.3mg/L IBA+0.15mg/L KT＋30mg/L Ad）、壮苗培养基（MS+0.3mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+0.1mg/L KT+20mg/L Ad）和生根培养基（1/2MS+0.1mg/L NAA+0.05mg/l IBA）。通过离体叶片再生的Kan梯度筛选实验，将转化芽的选择选压力定为40mg/l Kan。通过调整激素浓度、减少消毒时间、连续转移培养和加入吸附剂活性炭等方法解决了 WP=7 组织培养外植体的褐化问题；通过降低分裂素浓度、以透气性好的羊皮纸封口三角瓶、提高琼脂的浓度、生根移栽培养基采用1/2的MS培养基等方法解决了组培苗的玻璃化问题。 2. 构建了两个中间载体pUCGI和pUCG，两个表达载体pBI2和pBISN2。对载体构建的方法进行了研究探索。 3. 改良和优化了传统的农杆菌介导的转基因方法，提高了转化率，通过Kan筛选获得了大量转基因植株，并用PCR方法对转基因植株进行了鉴定，分析并消除了产生PCR污染的原因。 4. 对转基因的叶片进行了外源基因瞬时表达的GUS组织化学染色，发现在瞬时表达中SP启动子活性强于CaMV35S启动子。结果还发现，CaMV35S+GUS基因在农杆菌中也能表达；农杆菌中缺乏真核生物的拼接机制，所以CaMV35S ＋GUS-intron在农杆菌中检测不到GUS活性。因此GUS－intron基因比GUS基因更适合作为检测基因。 5. 对转基因植株进行了稳定表达的GUS组织化学染色和荧光定量分析，结果表明：SP启动子转化的杨树植株的叶片具有向基表达的特性，随着叶龄的增大，GUS活性也逐渐上升；SP启动子在茎部组织的活性高于CaMV35S启动子活性的6～8倍；虽然CaMV35S启动子在根部组织中的活性较高，SP启动子活性仍比CaMV35S启动子的高8～10倍，内含子的插入使转基因沉默的植株比例下降了20～30%。 6. 通过对内含子作用机理的分析，为杨树和其他植物的转基因工作提出了很有价值的理论依据