RNA介导的转基因马铃薯抗病毒研究

【摘要】： 马铃薯是一种广泛分布，具有重要地位的作物，但易受植物病毒的危 害而造成种质退化、减产。基因工程育种作为一种有效的培育抗病毒马铃 薯品种的方法具有很大的优越性：基因不受生物种类的限制，基因及其产 物已知，便于对基因产物的价值及其安全性进行研究，育种目标具体、准 确、快速、可预见性强。自从1986年Abel等人将TMV外壳蛋白基因导入 烟草，获得世界上第一例抗rI'MV的转基因植株以来，利用病毒本身的基因 来防治植物病毒病害已获得迅速发展。 本研究通过优化适合山东省马铃薯品种的高效再生体系和遗传转化 体系，获得转基因马铃薯，PCR检测结果证明马铃薯基因组含有目的基因 片段；同时对实验室已经获得转基因马铃薯进行转基因马铃薯抗性遗传及 抗性机制研究。具体结果如下： 1．马铃薯转基因受体系统的优化 利用山东省马铃薯品利，T、L、203为试材，选择确定以叶片为外植体 进行马铃薯组培，确定愈伤组织诱导培养基(10mg/L GA3、6．Omg／L 6-BA)、 分化培养基(6mg／L GA3、4．5mg／L 6-BA)中激素配比及绝对浓度，得到 了较高的诱导率和分化率。T、L、203诱导率分别为83％、87．8％、96．2％， 分化率为23．1％、15．9％、19．2％。 2．农杆菌基因转化体系的优化 确定了三个马铃薯品种T、L、203利用农杆菌基因介导外源基因转 化条件是外植体预培养时间为4天、农杆菌侵染外植体的浓度、时间，及 外植体与农杆菌共培养时间分别为4．24×10~8细胞／毫升，T、L为12分钟， 203为8分钟，共培养时间为3天，并获得了Kan抗性马铃薯试管苗9个 株系。 3．转基因马铃薯抗性遗传稳定性及抗性机制探索 ELISA检测转基因马铃薯病毒抗性数据显示，温室条件下，3个转基 因马铃薯株系(2M、3M、11M)具有病毒抗性，3个株系(1M、5M、10M) 感病；而田间抗性检测发现，温室表现感病的lM田间感病不明显。 WP=7 SotJthern blot分析证明，转基因马铃薯植株基因组中整合有CP基 因，但杂交带数目不同，1M、2M、3M、5M、lOM、11M分别为l、3、7、2、 l、4；N0thern blot分析表明马铃薯基因组中的CP基因得到了转录，信 号的强弱显示6个株系RNA积累水平不同，2M、3M、11M积水平较低，而 1M、5M、10M的积累水平较高。结合转基因马铃薯抗性，实验结果表明， 转基因马铃薯基因组中外源基因拷贝数、转基因RNA表达量与植株的病毒 抗性存在关系：(1)高拷贝数的转基因马铃薯具有抗性，而低拷贝数的转 基因马铃薯则表现感病；(2)转基因RNA积累量与转基因马铃薯抗病性呈 负相关。