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半胱氨酸蛋白酶基因的克隆及在家蚕生物反应器中的表达

林旭瑷  
【摘要】: 杆状病毒被广泛用来在昆虫细胞或虫体内表达有用蛋白,杆状病毒表 达载体系统(silkworm baculovirus expression vector system Silkworm。 BEVS)已成为一个表达具有生物活性和特性的重组蛋白的有力工具。为 了提高家蚕BEVS表达外源基因的效率和改善杆状病毒生物杀虫剂的杀 虫性能,本文应用杆状病毒表达载体系统在多角体强启动子的控制下,实 现了杆状病毒来源的半胱氨酸蛋白酶基因的表达。 本实验利用DNA重组技术将BmNPV-ZJ8株基因组DNA中的半胱氨 酸蛋白酶(cysteine protease,CP)基因克隆到通用载体pBluescript SK上, 构建了重组质粒pSK-CP。序列分析认为该蛋白酶基因的ORF为972个核 苷酸,编码323个氨基酸。同源性分析表明,BmNPVZJ8-CP在DNA水 平上与其它来源的CP具有较高的同源性,该半胱氨酸蛋白酶含有在组织 蛋白酶B、H、L、S及木瓜蛋白酶中保守的36个氨基酸残基中的31个。 根据己知的杆状病毒半胱氨酸蛋白酶基因序列构建了该基因的进化树,发 现BmNPVZJ8-CP与人的木瓜蛋白酶超家族的cp基因在同一进化分支上, 与BmNPV-T3株、AcNPV的半胱氨酸蛋白酶基因的核苷酸同源性最高, 而与HaNPV、HzsNPV、SeNPV、CpGV的cp基因则处于不同的同源组。 测序正确后将cp基因克隆到转移载体pVL1393上(pVL-CP)。通过 限制酶性切图谱分析鉴定,表明cp基因己正确插入转移载体,受多角体 蛋白基因启动子控制。 将cp基因克隆进原核表达载体pET-28a中(pET-CP),转化大肠杆 菌BL21,在大肠杆菌表达系统中进行表达。由于大肠杆菌表达系统是一 种原核表达系统,缺乏真核蛋白翻译后加工的场所,且半胱氨酸蛋白酶可 能特异性的降解大肠杆菌的蛋白质,因而表达产物对大肠杆菌本身的生长 WP=7 是一种有害物质,所以并没有获得有效的表达。通过对不同时相的大肠杆 菌生长情况进行了比较,说明在pET28a-CP/IPTG中含有一种能够抑制菌 体生长的物质,间接证明了在pET28a中插入的cp基因是有功能的,其表 达产物对大肠杆菌具有生理毒性。 利用病毒基因组线性化技术,在细胞培养的基础上,将重组转移载体 pVL-CP与经酶切线性化的亲本病毒(Bm-BacPAK6)在脂质体(1ipofectine) 的介导下共转染家蚕贴壁培养细胞Bm-5,发现含有cp基因的重组病毒与 对照的亲本病毒相比,感染效率较低,接种重组病毒的细胞裂解所需时间 反而延长。通过蓝白斑筛选、空斑分析、纯化得到只产生白斑的重组病毒。 用重组病毒注射家蚕5龄起蚕或嫩蛹,通过PCR分析证明半胱氨酸 蛋白酶基因在蚕体和蛹体中得到了表达,根据感染后不同时期半胱氨酸蛋 白酶的活力作表达时相曲线,发现重组病毒感染家蚕幼虫96h后cp基因 的表达产物开始迅速增加,在120h达最高峰,此后感染蚕体开始液化、 死亡;感染蛹体132h后,其半胱氨酸蛋白酶的表达量达最高值。 SDS-PAGE电泳分析发现,在标准蛋白分子量Marker的20~30 kD之间有 特异性条带,推测可能是cp基因的表达产物之一,由于蚕体本身的血淋 巴中30 kD左右的蛋白丰度极高,存在大量30 kD左右蛋白,分子量均为 30 kD左右,可能掩盖了cp基因的其它表达产物。通过活性测定表明, 本实验的表达产物具有生物学活性。酶学性质分析发现杆状病毒半胱氨酸 蛋白酶的最适反应温度为45℃、最适PH值为4.0,最大相对活力为1 600 LI/mL。 对含有cp基因的重组杆状病毒的杀虫效应作了初步探讨,注射感染 家蚕5龄起蚕或嫩蛹,发现重组病毒对宿主的致死能力与亲本病毒对比没 有明显区别,只是在虫体液化方面效果显著,因而推测本实验所得到的半 胱氨酸蛋白酶有可能应用于蚕体、蛹体蛋白水解及氨基酸纯化等蚕桑副产 WP=8 品综合利用上。


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