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鸡白细胞介素18成熟蛋白基因克隆与表达的研究

胡敬东  
【摘要】:白细胞介素18(Interleukin-18,IL-18)是一种新发现的重要的细胞免疫调节因子,主要由单核巨噬细胞系统的细胞分泌。起初由于它能诱导NK细胞和Th1细胞产生干扰素而被命名为干扰素诱生因子(Interferon-γ-inducing factor,IGIF),随着对IGIF的深入研究,人们发现它有其自身的结构特点和多种其它生物学活性,因此于1996年被正式命名为白细胞介素18。近年来有关人和各种动物IL-18的基因克隆、表达及生物学活性等研究十分活跃。目前在分子水平上已经证明,人、哺乳动物和某些鸟类中都有IL-18存在。IL-18在结构上属于IL-1家族,在功能上它与IL-12相似,且二者有协同效应。IL-18具有多种生物学功能,它不仅可以增强Th1型免疫反应,而且在Th2型免疫反应中也发挥一定的作用。人类医学研究证明IL-18在抗微生物感染、抗肿瘤免疫中具有应用潜力。鸡IL-18(Chicken interleukin-18,ChIL-18)基因是最近才被发现的,由于它具有与人和哺乳动物相似的生物学功能,因而鸡IL-18在比较免疫学研究和禽病防制中具有重要意义。在集约化家禽养殖业中,包括ChIL-18在内的细胞因子,目前已被普遍看作是一种具有广阔应用前景的新型免疫佐剂和免疫治疗剂。 本研究根据已发表的ChIL-18成熟蛋白(mature ChIL-18,mChIL-18)的cDNA基因序列,设计一对特异性引物,应用反转录-聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)技术从脂多糖(LPS)刺激10小时活化的马立克氏病成淋巴细胞样细胞系MDCC-MSB1的cDNA中扩增出编码鸡IL-18成熟活性蛋白的全长基因,对扩增片段进行T-A克隆,经PCR、酶切鉴定及测序验证,成功获得ChIL-18成熟蛋白完整基因的克隆。序列分析表明,所克隆到的ChIL-18成熟蛋白编码基因包括终止密码子在内全长为510 bp,含有一个开放阅读框架(open reading frame,ORF),这与Schneider等(2000)报道的结果完全一致。 鸡与人和其他11种动物的IL-18成熟蛋白基因序列分析表明,IL-18成熟蛋白基因存在种的多样性,亲缘关系越近,同源性越高。 在克隆到编码ChIL-18成熟蛋白的基因后,将此基因亚克隆至原核表达载体pGEX-6P-1中,构建重组质粒并进行确证性序列测定。然后将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)株中并用IPTG于37℃诱导培养获得表达,表达形式为包涵体。经过优化选择确定了重组ChIL-18(Recombinant ChIL-18,rChIL-18)蛋白高效表达的最适参数, WP=11 即当IPTG浓度为0.2 mmol/L,诱导时间为4h时,表达水平最高,凝胶薄层灰度扫描显示表达的融合蛋白约占菌体蛋白的32%。诱导菌体裂解物经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后,用兔抗GST抗体进行Western-blotting试验,结果确证了GST-mChIL18融合蛋白的表达,表达的鸡IL-18融合蛋白分子量约为44kDa,并对其进行了亲和纯化。 将表达产物从凝胶中回收,免疫4周龄小白鼠,三次免疫后,采血分离血清。用所得抗血清对SDS-PAGE后的诱导菌体裂解物进行Western blot检测,结果表明制备的多克隆抗体与ChIL-18具有良好的反应性。 将ChIL-18成熟蛋白基因的完整ORF进一步克隆入真核表达载体pcDNA3.1/V5-His-TOPO中,重组质粒pcDNA3.1TOPO-mChIL18在脂质体作用下转染鸡胚成纤维细胞(chicken embryonic fibroblast,CEF),在转染后24、48、72小时,用pGEX-mChIL18原核表达产物制备的抗血清对pcDNA3.1TOPO-mChIL18转染的CEF进行间接免疫荧光试验检测,结果检测到了mChIL-18在CEF中的表达,该试验也使mChIL-18基因在原核和真核系统中的表达得到了相互验证。 所有以上实验结果为下一阶段ChIL-18生物学特性及其应用的研究打下了坚实基础。


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