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双启动子表达载体的构建以及酯酶B1基因的表达

张韩杰  
【摘要】:农药是人们投放于环境中数量大?毒性广的一类化学物质?在过去几 十年中,有机氯?有机磷等农药的开发与应用曾为人类在农?林业防治病 虫害,提高农作物产量中起到了不可磨灭的作用?但那些性质比较稳定? 难以分解消失的有毒农药的长期?大量使用,已造成严重的全球性环境污 染和生态破坏?因此解决环境的农药残留问题已成为世界各国的研究热 点?本文旨在将已证明对有机磷?有机氯以及溴氰菊酯等类农药有良好降 解作用的抗性库蚊的解毒酶 B1 基因高效表达,为其实际应用创造条件? 影响外源基因表达的因素很多,主要可以归结为两个方面:1)转录 水平因素如启动子?终止子等;2)翻译水平因素如 SD 序列?密码子偏 好性等?本文主要从转录水平进行研究,即构建双启动子表达载体?将 CaMV35s 启动子插入表达载体 pRL439 中,构建新的表达载体 pRLdp, 使其含有 PpsbA和 CaMV35s 两个启动子?再将从抗性库蚊(Culex pipiens) 中分离的解毒酶基因即酯酶 B1 基因与双启动子表达载体在 T4DNA 连接 酶作用下进行体外连接,连接产物转化大肠杆菌 DH5α,在含 100μg/mL 氨苄青霉素的 LB 平板上筛选转化子,提取质粒,分别进行 XbaI 和 BamHI 单酶切,电泳分析得到酯酶 B1 基因插入方向正确的表达质粒 pRLdp-B1? 挑取鉴定正确的阳性单菌落,接种于 25ml 含 50μg/mL 氨苄青霉素 的液体 LB 培养基中,37℃,200rpm 培养过夜,通过不同转接量(0.5%? 1.0%?1.5%?2.0%?2.5%?3.0%)对酯酶活性影响的测定,确定 2%为最 佳转接量?按照 2%的接种量转接培养,在同样条件下培养 15 小时,离心 1 WP=7 双启动子表达载体的构建及酯酶 B1 基因的表达 收集菌体?菌体在加入样品提取液后反复超声?冻融破壁,4℃,10000rpm 离心 15min,取上清液进行 SDS-PAGE 聚丙稀酰胺凝胶电泳进行鉴定,得 到所需蛋白,与对照相比,表达量有所提高? 以 α-乙酸萘酯为底物对所构建工程菌进行酯酶活性测定,结果表明 该工程菌能高效降解 α-乙酸萘酯,具有较强的酯酶活性,通过与对照 pRL439-B1 工程菌的比较可以得出,pRLdp-B1 反应初速度较快,且延续时 间较长,具有较强的降解能力?


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