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小麦品质性状相关基因的分离及种子淀粉品质的遗传改良

李加瑞  
【摘要】:小麦是世界性的重要粮食作物,在我国是仅次于水稻的第二大粮食作物,其产量与品质直接关系人类食物的供应程度和营养水平。其中品质性状的改良对于丰富人们的食物来源,提高经济和社会效益具有非常重要的意义。本文以授粉后12 天的小麦种子为材料,构建cDNA 文库。从中随机挑选10,000 个克隆,利用Biomek 2000 核酸工作站制成高密度cDNA 阵列。然后分别以未受精子房、胚和胚乳中提取的RNA 为模板,反转录合成探针与膜杂交,进行差异筛选。根据筛选结果,选取800 个在胚、胚乳或胚和胚乳中表达的克隆进行表达序列标签(EST)分析,鉴定出216 个不同的基因序列。其中与小麦品质性状相关的基因有54 个,这些基因将为品质改良提供重要的基础资料。进而,为获取低直链淀粉的转基因小麦材料,通过上述cDNA microarray 杂交技术筛选出一个克隆GBSSI(编码颗粒结合型淀粉合成酶);然后构建RNAi 表达载体,通过农杆菌介导的方法转化小麦,通过PCR,RT-PCR 和叶片离体褪绿实验鉴定出4株转基因植株。对淀粉进行的碘试剂染色实验和淀粉含量的测定结果表明GBSSI 基因的RNA 沉默使转基因小麦种子直链淀粉的含量下降。主要结果和结论如下: 1.小麦种子cDNA 文库的构建 以授粉后12 天的优质小麦品种PH82-2-2 的种子为材料,构建cDNA 文库。首先利用总RNA 分离试剂盒(Promega) 提取总RNA,然后分离mRNA。cDNA 文库构建参照Gubler 和Hoffman 方法进行。所用试剂主要为TaKaRa 公司产品。载体为pBluescript II SK(+) (STRATAGENE) 。用于转化的感受态细胞是大肠杆菌TM109 Electro-cell (TaKaRa)。 2.cDNA microarray 杂交分析 从cDNA 文库中随机挑选10,000 个克隆,利用Biomek 2000 将质粒DNA 点于尼龙膜(12×8 cm)上,制成高密度cDNA 阵列,尼龙膜一式三份。然后分别以未受精子房、胚和胚乳中提取的RNA 为模板,反转录合成探针与膜杂交,进行差异筛选。 3. 杂交结果分析


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