马立克氏病病毒pp38基因及其上游双向启动子的生物学特性

【摘要】：马立克氏病病毒(Marek’s Disease virus, MDV)是一种对鸡群具有高度传染性和高度致肿瘤性的疱疹病毒。与MDV 致肿瘤相关的pp38 是一个独特的基因。迄今为止,在其它疱疹病毒以及其它生物体中均未发现与其有同源性的基因。现有的研究资料表明,pp38 与维持MDV 诱发的肿瘤细胞的转化状态、MDV 感染引起的免疫抑制和淋巴细胞的溶细胞感染相关,但对其分子水平的作用机制未见任何报道。在pp38 基因和另一个与肿瘤相关的1.8-kb mRNA 家族转录子基因间有一大小仅为300-bp 左右的双向启动子,但其核酸序列中却含有多个增强子元件,并且包含了MDV 基因组DNA 复制的原点。已有报道发现与MDV 感染相关的某些因子参与了该双向启动子活性的调控,但这些因子的性质还不清楚。在以上背景下,本研究就该双向启动子的结构与转录活性的关系,pp38 与该双向启动子在分子水平的相互作用及其对MDV 复制的影响等方面开展了比较全面和系统的研究,不仅积累了一些数据,还提出并实验验证了一些新的观点: 1.比较了不同致病型MDV 毒株和野毒株pp38 上游双向启动子的序列。用聚合酶链式反应(PCR)扩增了9 株不同致病型MDV 毒株双向启动子序列。这些毒株包括:弱毒疫苗株CVI988 和814,强毒参考株GA,超强毒参考株RB1B、Md5 和Md11,特超强毒参考株648A 及2 个中国野毒株GD2 和J-E。序列测定和分析结果表明:不同毒株间双向启动子的同源性大于95.9%,突变主要发生在MDV 复制原点附近。进化关系分析结果显示,CVI988 和814 两个弱毒株的亲缘关系最近。但是在强毒株、超强毒株及特超强毒株间没有显示出与致病型相关的规律性同源关系。CVI988 株的双向启动子有5 个核苷酸(5′-AGCCG-3′)缺失,从而导致一个sp1 位点的破坏。根据CVI988 双向启动子的5-bp 缺失区序列设计两对引物,建立了能区分CVI988 疫苗株和其它MDV 毒株的PCR 诊断方法。 2.以pp38 自身为报告基因,在细胞转染试验中证明了该双向启动子在二个方向的转录活性。将MDV pp38 基因插入到pUC18 质粒中,构建质粒pUC-pp38。再将包含双向启动子的长度为789-bp的核酸序列,分别按正、反两个方向克隆到pp38基因的上游,获得重组质粒pP(pp38)-pp38 和pP(1.8kb)-pp38。用这2 个重组质粒分别转染鸡胚成纤维细胞(CEF), 24h 和48h 后用间接免疫荧光试验(IFA)检测pp38 基因的表达。结果表明,重组质粒pP(pp38)-pp38 和pP(1.8kb)-pp38 在