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小麦叶片硝酸还原酶活性调控机制研究

刘丽  
【摘要】:NR 是植物氮代谢的关键酶,是一种诱导酶,NO_3~-对NR 的诱导有3 小时左右的滞后性,研究表明NO_3~-诱导酶蛋白的从头合成。蛋白合成抑制剂环己酰亚胺能在2~3 小时内抑制大部分NO_3~-对NR 的诱导,这也说明短时间内NR 还是主要源于酶蛋白的从头合成。NR 的诱导过程需要光,光提供NO_3~-还原所需的NADH,光诱导NR 主要是酶的合成依赖于光合作用。 将NR 纯化了242 倍。当pH 低于7.5 时,NR 的稳定性降低,而且随着pH 的降低,NR 的稳定性也降低。PH5.5 时和pH(7.5 时NR 稳定性的变化有差异。在pH 为7.5 时,NR 的稳定性良好。在pH 为7.5 时,NRA 最高。在15、25、30、40、50℃下保温时间越长,酶活力下降越快;保温的温度越高,,酶活力下降越快,其半衰期约是60、40、29、20、10 分钟。在温度为30℃时,NRA 最高。通过双到数作图法,得到NO_3~-与NADH 的Km 值分别为3.25×10~(-4) mol/L 和8.4×10~(-5)mol/L。在15~50℃范围内用InK 对(1/T)作图,得到28.2℃时的活化能:Ea 是48.7kj/mol(≈11.65kcal/m01),高于28.2℃时,活化能Ea 大大地高于15~30℃活化所需要的Ea。 通过40~70%饱和硫酸铵分级分离SDSephadex G-75 柱层析,得到纯化101.6 倍的小麦叶片NIP,在室温及中性环境对NRA 有明显的抑制作用。小麦叶片NIP 与NR 是可逆结合并发挥作用的,是NR 的竞争性抑制剂。NR 和DNIP 可能通过一定的作用力结合在一起,这种结合不是一瞬间完成的, 而是需要时间,NR—-NIP 复合物比游离态NR 的活性低。在NIPR 和NR 发生作用的过程中,可以检测到NR 的活性降低。从Guggenheim 点斜率图得到NIP 和NR 结合常数是0.1875。 Mg~(2+)对NR 有抑制效应。在光下保温的NR 溶液对Mg~(2+)的存在十分敏感, 33~39%的NRA 被抑制;而在暗处保温的NR 溶液对Mg~(2+)的存在不太敏感,仅10%~NRA 被抑制。在Mg~(2+)存在时,随着保温时间的延长,NIP 抑制NRA 的能力增强;而在Mg~(2+)不存在时,随着保温时间的延长,NIP 抑制NRA 的能力没有变化,这表明在NIP 和NR 结合的过程中,Mg~(2+)的存在是必要的。同时,在Mg~(2+)存在时,随着保温时间的延长,NR 磷酸化程度提高,NRA 状


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