冬虫夏草原生质体育种及液体富Zn、Se、Ge研究

【摘要】： 冬虫夏草(Cordyceps sinensis)目前难以规模化人工栽培,主要以野生冬虫夏草为主,过渡的滥采滥收造成资源稀少,生态环境遭到严重破坏,同时也远远不能满足市场需要。而虫草菌丝体中主要功效成分与野生冬虫夏草相当,且人工液体培养虫草菌丝体具有周期短、易控制、成本低、重复性好等优点。因此本课题对冬虫夏草菌丝体进行原生质体制备与再生,优化单酶或复合酶酶解条件,利用原生质体诱变技术,选育多糖高产量冬虫夏草诱变菌株,并以诱变菌株为载体,进行Zn、Se、Ge单元素和三元素富集,优化富集条件,以小白鼠为试材,对谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidsade,GSH-Px)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)等抗氧化指标进行初步检测,得到了以下结论: 1、冬虫夏草液体培养基最佳组成为:马铃薯20%,葡萄糖2%,酵母粉0.2%,水1000mL,pH6.0。在此条件下,25℃、160r/min振荡培养4d,生物量达到1.72g/100mL。 2、研究了不同酶系统、酶浓度、酶解温度、酶解时间、稳渗剂、pH值、培养时间对冬虫夏草原生质体形成的影响。结果表明,在30℃、pH6.0、1.5%溶壁酶条件下,以0.6mol/L氯化钾作为稳渗剂,酶解3h,原生质体产量达到4.35×107个/mL。 3、冬虫夏草原生质体适宜再生培养基为:麦芽糖2%,葡萄糖2%,蛋白胨0.2%,酵母粉0.40%,KH2PO4 0.20%,MgSO4·7H2O 0.15%,维生素B1 0.001%,维生素B6 0.001%。再生率达到38.07%。 4、冬虫夏草原生质体紫外线辐射至半致死率的照射时间约为20s。根据拮抗反应和生长状况,筛选出100株冬虫夏草原生质体紫外线诱变菌株,以原始出发菌株为对照,从中筛选出10株虫草多糖含量高于原始出发菌株的诱变菌株,编号为024、029、035、036、055、071、078、086、089、098。将10株诱变菌株及原始出发菌株分别连续传代10次,以出发菌株为对照,从中筛选出1株多糖含量更高的诱变菌株,编号为035。 5、诱变菌株优化培养基为:马铃薯20%,葡萄糖2%,酵母粉0.4%,KH2PO4 0.2%,MgSO4·7H2O 0.15%,菌丝体生物量达到1.260g/100mL。最佳发酵条件为:pH值6.5、温度25℃、接种量5%、转速120r/min。 6、冬虫夏草诱变菌株能够有效地对Zn、Se、Ge进行富集和转化,而且在较低浓度时能够促进菌丝体的生长。培养基中适宜的Zn、Se、Ge添加浓度分别为150μg/mL、60μg/mL、