嗜热毛壳菌热稳定糖化酶纯化及其编码基因的克隆与表达

【摘要】： 糖化酶,又称葡萄糖淀粉酶[Glucoamylase,系统命名为淀粉α-1.4-葡聚糖葡萄糖水解酶,α-1.4-Glucanglucohydrolase(EC.3.2.1.3)],是一种具有外切活性的酶,它能把淀粉、糊精、糖原等从非还原性末端水解α-1.4-葡萄糖苷键,而得到终产物?-D-葡萄糖,也能缓慢水解α-1.6-葡萄糖苷键,转化为葡萄糖,是淀粉转化为葡萄糖过程中的主要酶类之一。糖化酶具有重要商业价值,凡对淀粉、糊精、低聚糖进行酶水解的工业上,都可适用。尽管糖化酶对α-1.6-糖苷键的活性只有α-1.4-糖苷键的0.2%,这足以在工业糖化过程中影响产量。这一特性及在其他方面的需求产生现在研究人员对糖化酶的目标特定的蛋白质工程研究。 目前国内外已筛选出多种糖化酶生产菌,并将其分离提纯。但市场应用的糖化酶主要来源于常温菌,因产品成本高,热稳定性差,储存期短,酶活力和产率低而制约糖化酶在农业、工业上的应用。由此可见,热稳定性糖化酶的研究和开发具有重要的商业价值。 嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)是一种广泛分布的,生长上限温度较高的嗜热真菌,从该菌中已分离了多种嗜热酶,但未见该菌嗜热糖化酶的报道。本研究中C. thermophilum在以可溶性淀粉为唯一碳源的合成培养基中诱导产生了糖化酶,通过硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子层析、Phenyl-Sepharose疏水层析等步骤获得了凝胶电泳均一的糖化酶。SDS-PAGE测得所分离纯化酶蛋白的分子量约为64kDa。 该酶的最适反应温度和pH分别为65℃和4.0。在pH4.5条件下,该酶在50℃以下稳定,70℃的半衰期为20min。Ca2+,Mg2+,Na+,K+对酶有激活作用,一些重金属离子Fe2+,Ag+,Hg2+对酶有显著的抑制作用。该糖化酶是一种糖蛋白,含糖量为11.7%。 C. thermophilum热稳定糖化酶的N-端15个氨基酸序列为Ala-Val-Asp-Ser-Tyr-Ile- Glu-Arg-Glu-Thr-Pro-Ile-Ala-Trp-Asn,与Neurospora crassa,Humicola grisea和Thielavia terrestris糖化酶的N-端氨基酸序列有较高的同源性。 根据C. thermophilum热稳定糖化酶的N-端氨基酸序列和同源保守序列设计简并引物,通过RT-PCR及快速扩增cDNA末端(RACE)的方法,克隆了该糖化酶的编码基