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牛、鸡和猪γ-干扰素的克隆表达与单克隆抗体的研制

秦立廷  
【摘要】: 干扰素(interferon,IFN)是在特定的诱生剂作用下,由细胞产生的一种具有高度生物活性的糖蛋白,在同种动物细胞上具有广谱抗病毒活性。根据IFN蛋白的氨基酸序列、细胞来源以及它们所结合受体的不同,将其分为Ⅰ型IFN和Ⅱ型IFN,Ⅱ型IFN主要是γ-干扰素(interferon-gamma, IFN-γ),除具有Ⅰ型IFN抗病毒活性外,还具有独特的免疫调节功能和抗肿瘤作用。由于IFN-γ对机体免疫系统具有极大的调节作用,是机体发挥免疫功能,清除体内病原体不可缺少的成分,因此,IFN-γ在疾病的诊断、治疗和疫苗免疫效果检测等方面起着重大作用,是现代分子生物学,免疫学和临床医学研究的热点之一。 本研究通过PCR扩增出不包含信号肽的牛、鸡和猪IFN-γ的基因,分别构建了原核表达质粒pET-BoIFN-γ、pET-ChIFN-γ和pET-PoIFN-γ,转化BL21宿主菌,经IPTG诱导,表达牛、鸡和猪IFN-γ的重组蛋白。乳化后免疫兔子获得抗IFN-γ特异性免疫血清,抗牛、鸡和猪IFN-γ血清抗体效价分别为:1:1×10~4、1:1×10~6和1:1×10~5。 为了探讨牛、鸡和猪IFN-γ在真核细胞中的表达,从而获得具有高效抗病毒活性的重组IFN-γ,本研究构建了包含完整ORF的重组真核表达质粒pCAGG-BoIFN-γ、pCAGG-ChIFN-γ和pCAGG-PoIFN-γ,转染293T细胞,瞬时表达牛、鸡和猪IFN-γ重组蛋白,从而证实IFN-γ基因可以在哺乳动物细胞中表达,并能借助于自身的信号肽分泌到细胞外,通过VSV*GFP-MDBK(CEF、PK-15)系统细胞病变抑制法,测定重组IFN-γ具有高效抗病毒活性,牛、鸡和猪γ-干扰素抗病毒活性均为:2×10~5IU/ml。 为了大量获得在结构和功能等方面更接近天然,并且具有一定临床应用价值的重组IFN-γ,本研究构建了包含完整ORF的重组杆状病毒rBac-BoIFN-γ、rBac-ChIFN-γ和rBac-PoIFN-γ。间接IFA和间接


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