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鸭疫里默氏杆菌检测方法的建立

霍翠梅  
【摘要】: 鸭疫里默氏菌( Riemerella anatipestifer ,RA)病是一种主要侵害鸭、火鸡和其他鸟类的接触性传染病,该病又称为新鸭病、鸭疫综合征、传染性浆膜炎和鸭疫巴氏杆菌病等。该病主要病理变化是纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎、脑膜炎、干酪样输卵管炎等,发病率高,病死率也高。耐过鸭多成僵鸭,生长迟缓,造成极大的经济损失,是目前危害养鸭业的主要传染病之一。目前该病在检测上主要通过通过流行病学调查、临床症状、病理变化、细菌的分离鉴定、分子生物学检测及血清学检测。这些方法能够较为准确的检测出该病。 本实验主要建立了该菌的PCR检测方法和该病的间接ELISA检测方法,能够快速、准确鉴定。 本研究成功的建立了该菌的PCR检测方法。根据Genbank公布的鸭疫里默氏杆菌OmpA基因中ATCC株OmpA序列,应用DNAstar引物设计软件,在基因保守区设计了特异性引物,初步建立一种快速、经济、敏感的菌落PCR检测方法,以直接鉴定该菌。经分离鉴定1、2、10、11型16株菌,均扩增出670bp的特异性片段,表明该引物的可靠性。特异性试验结果表明,1、2、10、11型4参考菌株均能扩增出670bp特异性的核酸片段,而大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌的扩增结果均为阴性。敏感性试验结果表明, PCR的最低检出限量为80个鸭疫里氏杆菌。对新建立的菌落PCR及常规PCR方法进行扩增比较,结果表明菌落PCR和常规PCR的结果一致,均能扩增出相同大小的特异性条带,进一步证明了菌落PCR技术检测该菌的可靠性。 本研究成功的克隆表达了参照已知鸭疫里默氏杆菌外膜蛋白A(OmpA)全基因序列设计1对特异性引物,经PCR扩增得到目的片段约1164bp,然后克隆入pET-28a(+)载体中,经测序比较,与标准序列的核苷酸同源性达98.5%。转化BL21-DL3,经诱导后,SDS-PAGE结果显示,OmpA得到高效表达,Western-blotting检测呈阳性,可被RA1型和RA2型全菌兔血清识别。该研究为鸭疫里默氏杆菌的免疫检测提供了新的方法。 本研究用纯化的鸭疫里默氏杆菌OmpA蛋白作为包被抗原,初步建立了检测鸭疫里默氏杆菌的间接ELISA方法,并确定了ELISA最佳工作条件:抗原包被浓度为12.5μg/mL,4℃过夜,血清(1∶80)和酶标羊抗鸭IgG二抗(1:600)分别在37℃温育1h,底物溶液37℃显色15 min。特异性和重复性实验表明,该法特异性好、重复性高。


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