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猪附红细胞体套式PCR诊断方法的建立及人工感染动物模型的研究

孙英峰  
【摘要】: 附红细胞体病(Eperthrozoonsis)是附红细胞体(Eperthrozoon,简称附红体)寄生于红细胞表面、血浆、组织液及脑脊液中,引起贫血、黄疸、发热等的一种人、畜、禽共患的传染性疾病。近几年,国内对猪附红细胞体病的报道日益增多。为明确该病的发病、感染状况,本研究在对发病猪场进行疫情调查、临床症状、剖检病理变化、鲜血压片和血液推片染色诊断方法检查的基础上,建立套氏PCR诊断方法,并对该病建立人工感染动物模型,证实不同动物在附红细胞体的传播过程中发挥着重要作用。 本研究包括三个试验:试验一,猪附红细胞体病套氏PCR诊断方法的研究;试验二,猪附红细胞体病动物感染模型的建立;试验三,猪附红细胞体病在多种动物中交叉感染的研究。 试验一猪附红细胞体病套氏PCR诊断方法的研究 以无菌法采取自然发病的猪附红细胞体病的血液,用阿氏液抗凝后,从血液中分离纯化E.suis,提取DNA。根据GenBank收录的猪附红细胞体16S rRNA基因序列为例,设计两对特异引物,建立了一种快速、准确检测猪附红细胞体的套式PCR方法,凝胶电泳定性,经扩增后得到了一长度为498 bp的特异条带,测序鉴定确为目的片段;结果表明,建立的套氏PCR检测方法具有高度的特异性和敏感性,能够客观的反映附红细胞体病发病情况,可用于附红细胞体病的检测。 试验二猪附红细胞体病动物感染小鼠模型的建立 用多种诊断方法确定阳性血液样品,分别经腹腔、皮下及肌肉感染小鼠,定期采血,进行常规血涂片染色,并从血液中分离纯化E.suis,提取DNA,进行套式PCR法扩增,凝胶电泳定性,得到目的片段;在整个实验过程中未见感染小鼠明显的临床症状;附红细胞体的感染方式有以下几种:腹腔、皮下及肌肉感染。可以用小鼠建立猪附红细胞体动物感染动物模型,进行抗附红细胞体药物筛选。 试验三猪附红细胞体病在多种动物中交叉感染的研究 首先将诊断为阳性的猪附红细胞体血液,进行附红细胞体分离纯化,然后将纯化的猪附红细胞体人工感染大鼠、家兔和雏鸡三种实验动物,并用常规的诊断方法及所建立的套氏PCR方法进行检测,证明了猪附红细胞体在大鼠与家兔之间存有交叉感染,并同时说明了猪附红细胞体具有相对的宿主特异性,为防止该病的交叉的感染并造成流行提供了理论基础。


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