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疏绵状嗜热丝孢菌热稳定纤维素酶的分离纯化和基因克隆

贾汇红  
【摘要】: 纤维素酶是一组能降解纤维素的酶的总称。该酶广泛存在于各种微生物中,如细菌、真菌、放线菌等;此外,在动物中也发现该酶的存在。但到目前为止,对该酶的研究仍多以中温好气性木霉(Trichoderma)为主。因此,为了提高纤维素酶的产率和加速对纤维素酶降解纤维素机制的研究,一些极端条件下高活力的纤维素分解菌已经引起科研工作者的重视,尤其是对嗜热真菌(thermophilic fungi)的研究。嗜热真菌具有产酶快且产量大、分解纤维素效率高等特性,是一类非常具有开发潜力的纤维素分解菌。 疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)是一种广泛分布的,生长上限温度较高的一种嗜热真菌,本实验室从该菌中已分离了多种嗜热酶,但还未分离到β-葡萄糖苷酶和外切β-葡聚糖纤维二糖水解酶。本研究中Thermomyces lanuginosus在以微晶纤维素为唯一碳源的合成培养基中诱导产生了外切β-葡聚糖纤维二糖水解酶和β-葡萄糖苷酶,通过硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子层析、Phenyl-Sepharose疏水层析等步骤获得了凝胶电泳均一的外切β-葡聚糖纤维二糖水解酶和β-葡萄糖苷酶。经12.5% SDS-PAGE和凝胶过滤层析方法测得两种酶的分子量大小分别约为46.6kDa和47kDa及118kDa和120kDa。 外切β-葡聚糖纤维二糖水解酶的反应最适温度为60℃,最适pH值为5.0,在60℃保温30min活性丧失5%,在70℃时的半衰期为35min,在80℃保温10min仍具有60%的活性,80℃下酶的半衰期为25min,在90℃下保温10min仍有12%的活性。Na+、K+、Mn~(2+)对外切β-葡聚糖纤维二糖水解酶活性影响不大;Ca~(2+)、Ba~(2+)、Mg中文摘要纤维素酶是一组能降解纤维素的酶的总称。该酶广泛存在于各种微生物中,如细菌、真菌、放线菌等;此外,在动物中也发现该酶的存在。但到目前为止,对该酶的研究仍多以中温好气性木霉(Trichoderma)为主。因此,为了提高纤维素酶的产率和加速对纤维素酶降解纤维素机制的研究,一些极端条件下高活力的纤维素分解菌已经引起科研工作者的重视,尤其是对嗜热真菌(thermophilic fungi)的研究。嗜热真菌具有产酶快且产量大、分解纤维素效率高等特性,是一类非常具有开发潜力的纤维素分解菌。疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)是一种广泛分布的,生长上限温度较高的一种嗜热真菌,本实验室从该菌中已分离了多种嗜热酶,但还未分离到β-葡萄糖苷酶和外切β-葡聚糖纤维二糖水解酶。本研究中Thermomyces lanuginosus在以微晶纤维素为唯一碳源的合成培养基中诱导产生了外切β-葡聚糖纤维二糖水解酶和β-葡萄糖苷酶,通过硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子层析、Phenyl-Sepharose疏水层析等步骤获得了凝胶电泳均一的外切β-葡聚糖纤维二糖水解酶和β-葡萄糖苷酶。经12.5% SDS-PAGE和凝胶过滤层析方法测得两种酶的分子量大小分别约为46.6kDa和47kDa及118kDa和120kDa。外切β-葡聚糖纤维二糖水解酶的反应最适温度为60℃,最适pH值为5.0,在60℃保温30min活性丧失5%,在70℃时的半衰期为35min,在80℃保温10min仍具有60%的活性,80℃下酶的半衰期为25min,在90℃下保温10min仍有12%的活性。Na+、K+、Mn~(2+)对外切β-葡聚糖纤维二糖水解酶活性影响不大;Ca~(2+)、Ba~(2+)、Mg~(2+)离子对酶有明显的激活作用,Ag+、Zn~(2+)、NH4+等对酶有抑制作用。该酶的Km值为9.56 mg/mL,Vmax为22.12 mg/mL.min。β-葡萄糖苷酶的反应最适温度为60℃,最适pH值为5.0,在60℃保温1小时活性基本不丧失,在70℃的半衰期是15min,在80℃保温10min仍具有30%的活性。在90℃下保温10min仍有10%的活性。Ca~(2+)、Ba~(2+)、Mg~(2+)对β-葡萄糖苷酶有激活作用, Na+、K+、Mn~(2+)对酶活性影响不大,而Ag+、NH4+、Zn~(2+)对酶有显著的抑制作用。该酶的Km值为1.98mg/mL,Vmax为11.94mg/mL.min。离子对酶有明显的激活作用,Ag+、Zn~(2+)、NH4+等对酶有抑制作用。该酶的Km值为9.56 mg/mL,Vmax为22.12 mg/mL.min。 β-葡萄糖苷酶的反应最适温度为60℃,最适pH值为5.0,在60℃保温1小时活性基本不丧失,在70℃的半衰期是15min,在80℃保温10min仍具有30%的活性。在90℃下保温10min仍有10%的活性。Ca~(2+)、Ba~(2+)、Mg~(2+)对β-葡萄糖苷酶有激活作用, Na+、K+、Mn~(2+)对酶活性影响不大,而Ag+、NH4+、Zn~(2+)对酶有显著的抑制作用。该酶的Km值为1.98mg/mL,Vmax为11.94mg/mL.min。 根据12种真菌热稳定外切葡聚糖酶的同源保守序列设计兼并性引物,通过RT-PCR及快速扩增cDNA末端(RACE)的方法,克隆了疏绵状嗜热丝孢菌Thermomyces lanuginosus外切葡聚糖酶的编码基因cbh,全长cDNA为1710bp,包含一个由457个氨基酸组成的开放阅读框。通过Signal.P服务器的SignalP-NN和SignalP-HNN两种软件我们对推测的外切β-葡聚糖纤维二糖水解酶基因氨基酸序列进行了信号肽分析,结果发现外切β-葡聚糖纤维二糖水解酶基因cbh有一个信号肽切割位点,其位置为1-17,序列为MYQRALLFSFFLAAARA,说明该酶是一种分泌型的蛋白。


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