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轮枝镰孢及菌寄生真菌纤细齿梗孢蛋白激酶基因的克隆与功能分析

赵培宝  
【摘要】: 轮枝镰孢菌(Fusarium verticillioide)是一种重要的植物病原真菌,可引起玉米苗枯病、穗腐病等,纤细齿梗孢(Olpitrichum tenellum)是轮枝镰孢菌上的一种菌寄生真菌,为了研究纤细齿梗孢-轮枝镰孢菌-玉米之间的识别、互作、寄生和侵染致病机制,笔者以与信号传导有关的蛋白激酶基因为切入点并结合随机插入突变对此进行了探讨。摸索掌握了两种真菌原生质体制备技术;建立并优化了轮枝镰孢菌的REMI和ATMT遗传转化体系,获得了数十个突变体;克隆得到两种真菌的4个丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶基因;并通过同源重组成功敲除了轮枝镰孢菌的2个蛋白激酶基因,明确了它们的生物学功能。 1.掌握了两种真菌的原生质体制备技术,摸索了影响两种真菌原生质体制备的条件,包括菌龄、酶的种类和浓度、酶解时间和温度以及稳渗剂等,找到了两种真菌原生质体制备的最佳条件,其中轮枝镰孢菌采用PDB培养14h的菌丝,以0.7mol/LNaCl为稳渗剂,在30℃、100rpm下用20mg/mL溶壁酶酶解4h,原生质体制备量最大;而纤细齿梗孢采用PDB培养36~48h的菌丝,在30℃、100rpm下用30mg/mL溶壁酶酶解5h原生质体制备量最大。 2.以含有潮霉素磷酸转移酶基因的质粒pUC ATPH转化轮枝镰孢菌FT1菌株和纤细齿梗孢OL1菌株的原生质体,前者取得了成功,共获得转化子300多个,转接5代能稳定遗传,PCR验证潮霉素基因已插入转化子基因组DNA中,通过表型观察和致病性测定,发现许多生长异常突变体,2株致病性减弱突变体;而纤细齿梗孢没有得到转化子。 3.在植物转化载体pROKII基础上导入带有真菌启动子的潮霉素B抗性基因表达盒PtrpC-hph-TtrpC,构建了一个适合真菌转化的载体pROKII-PtrpC-hph-TtrpC,冻溶法转入农杆菌LBA4404。利用这一转化载体,成功地建立起了轮枝镰孢菌的ATMT遗传转化体系,获得了T-DNA插入突变体;而转化纤细齿梗孢却没有取得成功。摸索优化了转化条件,在镰孢菌孢子浓度106个/mL、农杆菌OD600=0.15~0.20、乙酰丁香酮浓度为200μmol/mL的条件下共培养36h转化效率最高,可达60~120个/106个孢子。共获得转化子1000多个,连续转接5代能够稳定遗传,PCR验证潮霉素B抗性基因已整合进转化子基因组DNA中,部分转化子表现为生长和形态异常。 4.利用兼并PCR,TAIL PCR和RACE技术相结合克隆得到两种真菌的四个丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶基因,分别命名为fpk1、fmk1、opk1和omk1 (GenBank登录号分别为:EF405958、EU417814、EU417815和EU479712)。其中fpk1由ATG到TAA的DNA全长1854bp,包含3个内含子,长度分别为66bp、54bp、54bp;cDNA全长1680bp,编码559个氨基酸的多肽,序列比对和分析显示其属于cAMP依赖的蛋白激酶PKA。opk1基因自ATG到TAA的DNA全长2223bp,包含2个内含子,分别长108bp、84bp,cDNA全长2031bp,编码676个氨基酸的多肽,序列比对和cAMP依赖的蛋白激酶同源性较低,可能属于另外一种Ser/Thr蛋白激酶。fmk1和omk1属于Fus3/Kss1类MAPK基因,cDNA全长均为1068bp,编码355个氨基酸的多肽,前者DNA全长1242bp,包含3个内含子,长度分别为58bp、56bp和60bp;后者DNA全长1198bp,包含2个内含子,长度分别为57bp和73bp,内含子边界均符合GT-AG规则。 5.依据同源重组原理,以pUCATPH和pBS为基础构建了基因fpk1和fmk1的敲除突变载体pBS-K-hph和pUCATPH-KS-KX,以REMI介导的转化手段转化轮枝镰孢菌原生质体,成功筛选到了fpk1和fmk1基因敲除突变体。通过对突变体的表型特征进行研究分析,明确了两基因的生物学功能,证实两基因与菌丝生长、胞壁分化、孢子产生和萌发以及致病性等密切相关。


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