收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

含双病原物诱导启动子植物安全表达载体的遗传转化及表达活性分析

王丹丹  
【摘要】: 植物抗病基因工程是植物抗病育种常用的工具之一,利用病原物诱导启动子驱动功能基因以提高植物的抗病性比组成型启动子有明显的优势。植物在环境中经常同时遭受不同病原物的为害,因而植物需要广谱的抗病性。由于单个启动子受诱导因子谱的限制,利用单一病原物诱导启动子驱动功能基因的表达,对入侵病原物的打击范围是有限的。 本研究把两个具有高度病原物诱导特异性的启动子EAS4和hsr203J构建到同一个植物表达载体上,通过对烟草的遗传转化,分析转基因植株中启动子的诱导表达活性,说明串联两个启动子,可以增加诱导因子的范围,扩大转基因植物的抗病谱,这对于抵抗几种病原物的侵染尤其有重要意义。同时,出于对转基因安全性的考虑,利用两个T-DNA边界将目的基因与抗生素抗性基因分开,通过转基因植株的后代自交分离,获得了只含目标基因而不含抗生素标记的转基因植株。所得结果如下: 1、构建了含双病原物诱导启动子的植物表达载体,并对烟草进行了遗传转化 以pCAMBIA2301为基本构架,选用两个来自烟草的、具有高度病原物诱导特异性的启动子EAS4和hsr203J,替换驱动uidA(报告基因GUS)基因表达的CaMV 35S启动子。为了分析串联的两个启动子活性是否有位置效应,同时构建启动子串联次序不同的两种植物表达载体HP1+EP2(hsr203J+EAS4+uidA)和EP1+HP2(EAS4+hsr203J +uidA),并分别以单启动子hsr203J和EAS4驱动uidA为对照,构建了四个表达载体。通过农杆菌介导的叶盘转化法将表达载体转化烟草。对200株抗生素抗性植株进行PCR筛选,共获得152株PCR阳性植株。 2、转基因植株中启动子表现明显的诱导表达活性,双启动子比单一启动子表现更强的诱导表达活性 为检测转基因植株中启动子的诱导表达活性,从RNA水平、GUS的定性、定量检测等方面,对不同病原物诱导的启动子活性进行了研究。 2.1随机选取30株PCR检测呈阳性的植株,用激发子parasiticein处理后提取诱导部位组织的总RNA,经RT-PCR检测,发现24株(80%)获得了与GUS基因预期大小一致的特异性片段,表明这些转基因烟草中GUS基因经诱导后可在转录水平上表达。 2.2选取14株RT-PCR呈现阳性的植株,分别用烟草黑胫病菌( Phytophthora nicotianea [0] )、烟草青枯病菌( Ralstonia solanacearum)、灰霉病菌(Botrytis cinerea)和激发子parasiticein等诱导处理,经组织化学染色发现,在检测的植株中,除单一启动子ESA4不受灰霉菌诱导外,经其它病原物处理的植株都不同程度地被染成蓝色,而清水处理的叶片几乎没有颜色变化或仅有很轻微的背景色,表明,本研究所构建4个表达载体中,启动子都具有病原物诱导表达的活性,并且,双启动子较单启动子表现出更为广泛的诱导谱。 2.3为明确单、双启动子是否存在诱导表达量的差异,用荧光法对GUS基因的诱导表达活性进行了定量检测。结果发现,转基因植株经P. nicotianea[0]、R. solanacearum和激发子parasiticein诱导后6h,双启动子HP1+EP2的诱导表达活性比单启动子hsr203J高5.9-8.0倍,比EAS4高6.7-7.9倍;双启动子EP1+HP2比单启动子hsr203J的诱导表达活性高5.0-5.7倍,比EAS4高4.7-6.5倍,双启动子与单启动子的活性差异均达极显著水平。双启动子HP1+EP2和EP1+HP2的诱导表达活性也存在极显著差异,而两个单启动子HP1和EP1之间没有明显差别。 2.4同时,用荧光法对GUS的诱导表达活性进行了动态检测,发现双启动子HP1+EP2的诱导表达高峰一般出现在诱导后6-10h,而双启动子EP1+HP2的活性高峰一般在诱导后8-14h。在检测的时间范围内,双启动子的诱导活性始终高于单一启动子。 这些结果说明,本研究所构建的4个载体中,启动子都具有病原物诱导表达活性,都可被多种病原物诱导表达。双启动子不仅有更广泛的诱导表达谱,而且诱导表达活性显著高于单启动子。 3、转基因株系在T1代可以实现NPTII基因与功能基因uidA的自由分离,获得不含抗生素标记的、安全的转基因后代 抗生素标记是转基因植物安全性所关注的重要内容之一,出于对转基因植物安全性的考虑,在载体设计时引入了双边界序列,把卡那霉素抗性基因NPTII表达盒和uidA基因表达盒分开在不同的T-DNA区,通过转基因植株后代的自交分离,筛选获得只含目的基因而不含NPTII的转基因植株。 首先对14个转基因株系的T1代幼苗用含卡那霉素的平板进行了表型检测,结果发现,13个株系的NPTII基因的分离比平均为2.89:1,接近3:1,表明这13个株系中NPTII基因可能为单拷贝插入。 为检测NPTII基因与uidA在T1代中是否发生自由分离,从13个NPTII单拷贝株系的T1代植株中随机选取130株,提取基因组DNA,PCR法对其NPTII基因和uidA基因同时进行扩增,结果是:只含uidA基因的植株占被扩增整体的20.77%,只含NPTII基因的占22.31%,同时含有NPTII基因和uidA基因的为53.85%,其分离比经X2检测符合两个相互独立的基因自由分离的比例9:3:3:1。说明转基因植株中NPTII基因与目标基因分别插入植物总DNA的不同部位,并在自交后代中发生自由分离。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 程振东,卫志明,许智宏;用PEG法把外源基因导入甘蓝型油菜原生质体再生转基因植株[J];实验生物学报;1994年03期
2 章善庆,童汉华,薛锐,华志华,汪晓玲,黄大年,谢小波;利用bar基因导入恢复系提高杂交稻纯度的尝试[J];中国农业科学;1998年06期
3 徐莺,白永延,卫志明,许智宏;Shiva A 基因在转基因烟草中的表达及其对烟草青枯病菌(Pseudomonas solanacearum pv tabaci)的抗性[J];实验生物学报;1999年01期
4 刘庆忠,赵红军,Freddi Hammerschlag;提高苹果基因转化效率的研究[J];果树学报;2000年03期
5 朱常香,宋云枝,亓苏伟,郑成超,温孚江;农杆菌介导水稻幼胚转化获转基因植株[J];山东农业大学学报(自然科学版);2000年01期
6 黄健秋,卫志明,安海龙,徐淑平,章冰;根癌土壤杆菌介导的水稻高效转化和转基因植株的高频再生[J];植物学报;2000年11期
7 程磊,周根余,沈革志;根癌农杆菌介导的水稻遗传转化(综述)[J];上海农业学报;2000年04期
8 毛碧增,单兰兰,范魏巍,赵丽涵,李德葆;盆栽非洲菊基因枪介导法转化体系的建立[J];细胞生物学杂志;2004年06期
9 沈革志;王新其;殷丽青;王慧梅;;籼稻转反义蜡质基因后代的直链淀粉含量测定和纯系选育[J];实验生物学报;2004年06期
10 王景雪,杜建中,荣二花,李晓灿,孙毅;油菜下胚轴农杆菌介导法转化影响因素探讨[J];华北农学报;2005年02期
11 林秀峰,邢少辰,刘志铭,王艳;盐胁迫对转BADH基因水稻R1的影响[J];吉林农业科学;2005年05期
12 郎春秀,陈笑芸,王伏林,吴关庭,胡张华,陈锦清;酶液处理法制备转基因植株PCR DNA模板的研究[J];浙江农业学报;2005年05期
13 林春晶;董英山;林秀峰;王继春;田文忠;储成才;;转抗稻瘟病基因水稻遗传和表达的初步研究[J];分子植物育种;2006年02期
14 王军卫;杨凤萍;陈绪清;梁荣奇;张立全;耿东梅;张晓东;宋亚珍;张改生;;外源脱水应答转录因子DREB基因在转基因小麦中的诱导型表达与抗干旱生理效果研究(英文)[J];遗传学报;2006年05期
15 赵凌;王才林;张亚东;朱镇;杨杰;黄骏麒;龚蓁蓁;;花粉管介导的转抗冻蛋白基因(AFP)水稻[J];江苏农业学报;2006年04期
16 刘明秋;张立全;格根通拉嘎;苗素平;扈廷茂;;农杆菌介导人肝再生增强因子转化河套蜜瓜的研究[J];内蒙古大学学报(自然科学版);2006年06期
17 李义良;苏晓华;张冰玉;张志毅;;外源SacB基因在银腺杂种杨基因组中的表达及抗旱性分析[J];北京林业大学学报;2007年02期
18 宋孝霞;张兴国;穆胜玉;王慧霞;;农杆菌介导的蔗果寡糖基因转入番茄研究[J];重庆科技学院学报(自然科学版);2007年01期
19 哈斯阿古拉;牛一丁;张丽;包常华;李建国;方天祺;扈廷茂;;花粉管通道法转基因技术在甜瓜品种河套蜜瓜上的应用[J];内蒙古大学学报(自然科学版);2007年04期
20 杜建中;孙毅;王景雪;郝曜山;刘龙龙;李润开;;转基因抗丝黑穗病玉米的遗传、表达及选育研究[J];分子植物育种;2007年04期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 王丹丹;刘爱新;唐丽丽;孔维文;;双病原物诱导启动子驱动的GUS基因活性分析[A];江苏省植物病理学会第十一次会员代表大会暨学术研讨会论文集[C];2008年
2 樊继德;孔庆国;张梅;于喜艳;;子房注射法获得转基因甜瓜植株[A];中国园艺学会第七届青年学术讨论会论文集[C];2006年
3 姜廷波;陈虹;李凤娟;丁宝建;;转柽柳金属硫蛋白基因(MT_1)烟草的获得及对重金属镉的抗性分析[A];中国遗传学会功能基因组学研讨会论文集[C];2006年
4 吕慧贞;张士刚;刘静;张元湖;;α-Farnesene合成酶基因转入烟草中的研究[A];2007中国植物生理学会全国学术会议论文摘要汇编[C];2007年
5 王玉成;杨传平;刘桂丰;;DREB基因的抗逆生理与分子机制研究[A];东北三省及内蒙古地区遗传学研究进展学术研讨会论文汇编[C];2009年
6 杨青川;康俊梅;;半胱氨酸蛋白酶基因表达载体的构建及转基因苜蓿的初步研究[A];中国草学会牧草育种专业委员会2007年学术研讨会论文集[C];2007年
7 饶雪琴;周国辉;张曙光;李华平;;番木瓜环斑病毒Ys株系复制酶和Vb株系衣壳蛋白融合基因的克隆和转化[A];中国植物病理学会2005年学术年会暨植物病理学报创刊50周年纪念会论文集[C];2005年
8 伍小兵;成雨洁;邓西平;;转入Cu/Zn SOD和APX基因对甘薯幼苗冷后恢复的作用[A];第六届全国SOD学术研讨会论文集[C];2009年
9 陈敏;陈珈;王国英;王学臣;;水稻Na~(+/)H~+反向转运器基因(OsNHX1)转化玉米及耐盐转基因植株的获得[A];中国植物生理学会全国学术年会暨成立40周年庆祝大会学术论文摘要汇编[C];2003年
10 尹小燕;杨爱芳;张可炜;张举仁;;转AtNHX1基因玉米的产生及其耐盐性分析[A];中国细胞生物学学会第八届会员代表大会暨学术大会论文摘要集[C];2003年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 马晖;水稻磷脂酰肌醇信号传导途径中一磷酸磷脂酰肌醇激酶(OsPIPK1)的分子遗传分析[D];中国科学院研究生院(上海生命科学研究院);2004年
2 徐晓丽;在转基因水稻种子里表达细菌α-淀粉酶和真菌葡萄糖淀粉酶[D];浙江大学;2007年
3 李焰焰;白菜花粉发育相关基因BcMF13和BcMF14的分离及其功能验证[D];浙江大学;2008年
4 景岚;草酸氧化酶基因转化烟草和油菜的研究[D];西北农林科技大学;2004年
5 渠慎春;转番茄铁载体蛋白基因(LeIRT2)八棱海棠的鉴定[D];南京农业大学;2005年
6 白庆荣;利用RNA介导的病毒抗性培育双抗病毒转基因植株[D];山东农业大学;2004年
7 范伟全;人bFGF基因转化大豆毛状根表达体系的实验研究[D];吉林大学;2007年
8 赵伟;小麦TaFIL与TaCRC基因的分离及功能分析[D];山东农业大学;2004年
9 陈惠;转基因耐盐旱稻的获得及转AtNCED3水稻的抗逆性研究[D];中国农业大学;2005年
10 柴晓杰;玉米淀粉分支酶基因表达调控的研究[D];吉林农业大学;2005年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 王丹丹;含双病原物诱导启动子植物安全表达载体的遗传转化及表达活性分析[D];山东农业大学;2008年
2 缪建锟;通过可诱导的信号途径提高植物的持续抗病性研究[D];石河子大学;2007年
3 冯翠莲;转基因烟草的遗传稳定性分析及其抗逆性测定[D];华南热带农业大学;2004年
4 贾庆利;外源基因在拟南芥转基因植株中的遗传研究[D];西北农林科技大学;2004年
5 王国良;农杆菌介导的紫花苜蓿BADH基因高效转化体系的优化和转基因植株的检测[D];甘肃农业大学;2004年
6 李志亮;高羊茅抗渗透胁迫基因工程改良的研究[D];河北师范大学;2004年
7 常玉广;小黑杨花粉植株转抗虫基因的研究[D];东北林业大学;2004年
8 魏明;植物气味生物工程研究(I):植物挥发性物质的监测和分析技术[D];中国科学院研究生院(上海生命科学研究院);2004年
9 徐文丽;抗冻蛋白基因转化烟草及转基因植株抗寒性研究[D];北京林业大学;2005年
10 吴立柱;小麦糖原合成酶激酶(TaGSK1)的亚细胞定位及其功能鉴定[D];河北师范大学;2004年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 燕民;生物技术在果树上的应用[N];农民日报;2000年
2 张振霞;理想的牧草离我们越来越近[N];科技日报;2001年
3 张振霞;理想的牧草离我们越来越近[N];科技日报;2001年
4 记者 蒋建科;中国农科院将体改推向纵深[N];人民日报;2001年
5 科技部技术预测与国家关键技术研究;植物转基因技术可增加农民收入[N];经济参考报;2004年
6 苏力;我国培育出转Bt基因抗虫油菜品系[N];农民日报;2004年
7 刘正午;转基因抗体药物“大市场”渐显[N];医药经济报;2005年
8 本报记者 谈琳;蓝色“妖姬”缘何“难产”[N];科技日报;2008年
9 夏树让;生物技术提升果蔬产业效益[N];中华合作时报;2003年
10 北农;我国首次培育出抗病毒转基因白菜[N];山东科技报;2001年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978