硫丹降解菌的筛选、鉴定及降解机理研究

【摘要】： 硫丹(Endosulfan)是一类广谱环戊二烯类杀虫剂,主要用于果树、蔬菜、谷物、棉花、树木及观赏植物的害虫防治,年使用量非常大。由于硫丹有效期长,对鱼类具有较大危害性,并对哺乳动物具有积累毒性,由此带来的环境污染问题也受到人们的普遍关注,因此利用微生物降解硫丹已成为近年来研究的热点问题之一。 本研究应用富集培养法,筛选分离到两株高效硫丹降解细菌,对硫丹降解菌在液体培养基以及土壤中的降解特性和降解机理进行研究;并对硫丹降解菌解毒性能及其降解酶的降解特性进行了研究。主要研究结果如下: 1.从农药厂的污水处理池活性污泥中筛选获得2株硫丹降解菌CS5和C7,通过形态学、生理生化和16S rDNA序列同源性分析,将其分别鉴定为木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)、苍白杆菌属(Ochrobacterum sp.);其16S rDNA基因序列在GenBank中的注册号分别EU266588、EU647578。 2.菌株CS5对硫丹的最大耐受浓度达550 mg/L,可用于进一步的降解性能的研究。在纯培养条件下,利用高效液相色谱(HPLC)法,分别测定了菌株在不同液体培养基中对硫丹的降解。在pH 7和30℃条件下,细菌CS5在无机盐培养基MM、含碳无机盐培养基NSM和含硫的无机盐培养基MSM中都能将50 mg/L的硫丹在8天内降解到80%以上;同时测定了硫丹作为碳源或硫源、以及不同接种量、温度、pH对菌株降解能力的影响。结果表明:以硫丹为唯一碳源或硫源、接种量15%～25%、温度25℃～35℃、pH 7～9、菌株的降解效果较好。 3.在接入菌株CS5的土壤样品中,经过30天的降解后α-硫丹和β-硫丹的降解率都分别达到了74.2%和73.5%以上。说明菌株CS5在土壤中对于加快硫丹的降解起到了显著作用,由此说明菌株CS5在被硫丹污染土壤修复中的应用潜力。 4.经高效液相色谱(HPLC)和薄层色谱(TLC)测定微生物对硫丹的代谢途径表明,硫丹二醇是最主要的降解产物,由此说明菌株CS5主要是通过水解的途径降解硫丹。 5.利用Salmonella typhimurium TA1535/pSK1002进行的umu-test实验检测到了硫丹在降解后遗传毒性的降低。在8天的降解过程中,在三种培养基中硫丹的遗传毒性伴随着硫丹的降解都有显著的降低,8天后的R值都小于2,检测结果都为阴性:在无机盐培养基MM中R值从3.5下降到1.28;在含硫无机盐培养基NSM中R值从3.5下降到1.14;在含硫无机盐培养基MSM中R值从3.5下降到1.15,而在空白对照中R值几乎没有什么变化。在30天的土壤中的降解过程中,硫丹的遗传毒性也是显著降低的,最后在灭菌的和未灭菌的土壤中的检测结果都为阴性。 6.运用SDS-PAGE和Native-PAGE对诱导和非诱导条件下菌体的全细胞蛋白质电泳分析表明,硫丹降解酶在菌株CS5中可能为组成型表达。各菌株粗酶活性分析表明,粗酶液能将50 mg/L的硫丹快速降解;降解酶在pH 5.5～7.5和30℃～45℃活性较高,最适pH 7,降解酶最适温度为40℃;此粗酶液可用于农产品表面的农药残留的快速清除和解毒。