泰山赤鳞鱼BMP11基因表达规律及分子进化研究

【摘要】： 泰山赤鳞鱼(Varicorhinus sp.),是泰山的一种珍贵野生鱼种,肉质分析结果显示泰山赤鳞鱼具有极高的营养价值和特殊的药用价值。为保护这一珍贵的野生鱼种,改良其种质资源,增加其产量,本文首先对泰山赤鳞鱼卵胚胎发育进程和特征进行了观察研究,结果发现泰山赤鳞鱼卵为沉性卵,稍呈粘性,呈橙黄色或淡黄色,未吸水的卵直径为1.65 mm～1.82 mm,吸水后卵径最大达2.38 mm～2.45 mm。在水温22.5℃～24.5℃的条件下,泰山赤鳞鱼卵历时46 h 50 min完成整个胚胎发育过程,经过了胚盘形成期、卵裂期、囊胚期、原肠期、神经胚期、器官形成期、孵化期7个主要阶段。初孵仔鱼全长6 mm～6.5 mm,肌节数为46～48,具心跳、血液循环、无色素。 在此基础上克隆了泰山赤鳞鱼BMP11的cDNA序列,并研究了此基因在不同胚胎发育时期及不同组织中的表达状况。从泰山赤鳞鱼的cDNA中扩增出一条643bp的条带,与斑马鱼的BMP11序列同源性高达92.34%,证明了此基因在不同物种间有高度的保守性。选择了11个不同的胚胎发育时期研究BMP11基因的表达规律,结果表明:BMP11基因在原肠晚期开始表达,虽然表达量并不恒定,但是在整个胚胎发育期都有表达,证明这是一个胚胎发育的重要基因。另外,检测BMP11基因在三个年龄的鱼(1龄,2龄,5龄)不同组织中的表达规律。研究表明:不同的年龄阶段表达存在差异,但还存在一些共同的规律:在肌肉、鳃、卵巢、脑中表达量均较高;在脾脏、肾脏、肠中都比较低。 为了确定泰山赤鳞鱼的分类地位,并研究泰山赤鳞鱼与本亚科其他鱼类的进化关系,本文克隆了cytb和D-loop全序列。结果表明cytb全序列为1140bp,没有插入和缺失,其中单态位点828个,多态位点312个,占整个序列的27.37%。碱基含量平均为T 27.3%、C 29.1%、A 29.1%、G 14.5%,T+A(56.4%)明显高于G+C(43.6%)。转换明显多于颠换Ts/Tv=4.6。基于cytb序列的聚类结果表明:四种聚类树上都可明显看出泰山赤鳞鱼和多鳞铲颌鱼聚在一起,二者为同种鱼。从聚类树还可看出所研究的鲃亚科鱼类共聚为5大支系,分别属于鲃亚科的五个属:突吻鱼属、光唇鱼属、倒刺鲃属、四须鲃属和金线鲃属。在突吻鱼属内泰山赤鳞鱼和多鳞铲颌鱼先聚在一起,然后和白甲鱼聚类,二者关系很近,远远没有达到亚属的分化水平。厚唇鱼和细身光唇鱼个体之间分别聚类后又聚在一起,明显属于同属鱼类;刺鲃和倒刺鲃也是分别聚类后又聚在一起,同属于倒刺鲃属的不同亚属;金线鲃属两个种聚在一起;宽头四须鲃单独为一类,这与5属鱼类的地理分布大致吻合。泰山赤鳞鱼与鲃亚科其他属的亲缘关系为:泰山赤鳞鱼与光唇鱼属的关系最近,其次是倒刺鲃属,与四须鲃属和金线鲃属的关系都较远。 基于本文的研究结果,根据分子钟推断了泰山赤鳞鱼与鲃亚科其他鱼类的分化时间。金线鲃属和泰山赤鳞鱼关系最远(15.2%～16.5%),分化时间大约是三千二百万年前;其次是四须鲃属( 14.2%～15.0 %),分化时间大约在二千九百万年前;与倒刺鲃属的分化( 13.0%～14.6% )大约在二千八百万年前;光唇鱼属和泰山赤鳞鱼关系最近(10.7%～13.8%),分化时间大约在二千四百万年前。 D-loop全序列约1024bp,在序列中有一个微卫星存在,因此个体间多态性主要是微卫星核心序列重复数不同造成的。变异位点11个,占整个序列的1.74%。碱基含量平均为T 32.4%、C 20.8%、A 33.6%、G 13.3%。转换稍高于颠换Ts/Tv=1.5。根据D-loop全序列分析了泰山赤鳞鱼和多鳞铲颌鱼个体之间的遗传距离为0%～0.5%,与泰山赤鳞鱼(0.1%～0.6%)和多鳞铲颌鱼(0%～0.5%)个体之间的距离几乎一样。而与作为外群的鲮鱼之间的距离分别为:20.3%～20.8%和20.2%～20.5%,也基本上是一样的。从四种聚类图上均可看出,泰山赤鳞鱼和多鳞铲颌鱼聚在一起,两类群之间没有任何分别。 本文还利用5对多态性很好的微卫星引物进行扩增,然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,利用软件分析了两个群体的基因频率、哈代-温伯格平衡、遗传距离和遗传相似性,发现泰山赤鳞鱼和多鳞铲颌鱼的多态性很差,都是非常纯合的群体。两个群体遗传距离非常小,为0.0113,而遗传相似性高达0.9887。 因此,无论从核外mtDNA cytb、D-loop全序列分析,还是从核内DNA微卫星标记分析均可看出泰山赤鳞鱼和多鳞铲颌鱼聚在一起,二者没有分别。