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玉米根系蛋白磷酸酶基因ZmPP2C功能分析及遗传转化研究

刘丽霞  
【摘要】: ZmPP2C(AY621066)是本实验室从玉米根系中分离的一个蛋白磷酸酶基因,其编码区长度为873 bp,编码含有290个氨基酸残基的蛋白质。为了研究ZmPP2C功能,我们首先将ZmPP2C与GFP在洋葱表皮内融合表达,发现该基因是在核内表达;然后又利用花序浸染法转化拟南芥,通过基因组PCR、半定量RT- PCR以及Western blot分析证实,该基因已经成功转入拟南芥染色体中并在蛋白质水平上表达。我们对获得的T3代转基因拟南芥纯合体,在逆境胁迫处理下,进行种子萌发、根的伸长以及各种生理指标的测定。并将该基因成功转化玉米。主要结果如下: 1.玉米中ZmPP2C基因与拟南芥等其他植物中的同源性比较 利用Invitrogen软件包中的alignX软件,对分别来自于所有拟南芥中蛋白磷酸酶,以及与拟南芥、玉米、大麦、水稻、苜蓿等已经研究过的PP2C蛋白进行了分子聚类分析,分别构建了ZmPP2C蛋白的系统进化树。进化树分析表明,ZmPP2C与冰叶日中花植物中的MPC9同源性较高。与拟南芥中PP2C类蛋白的F类同源性较高。 2.玉米ZmPP2C基因的表达分析 对玉米幼苗进行甘露醇模拟干旱和高盐胁迫处理,提取根系总RNA进行Northern杂交,结果表明,干旱和高盐胁迫均对ZmPP2C基因的表达影响不明显,且表达水平随着胁迫时间延长略微下降;而在逆境恢复阶段,基因表达量又逐渐恢复到正常水平。 3.玉米ZmPP2C基因的亚细胞定位 构建表达载体pBI121- ZmPP2C-GFP,将ZmPP2C-GFP在洋葱表皮细胞内融合蛋白表达。在洋葱表皮细胞的细胞核上观察到绿色荧光,表明ZmPP2C定位于细胞核。而在对照细胞中的细胞膜、细胞质和细胞核中都有表达。这与TMpred软件对ZmPP2C跨膜结构分析一致。 4.转ZmPP2C基因拟南芥的鉴定 构建表达载体pBI121-ZmPP2C ,利用花絮浸染法转化野生型拟南芥(Col-0)。通过半定量RT-PCR和Western blot方法,在转录和蛋白质表达水平上鉴定了5株高表达的T3代转化植株(L1~L5)。 5.过量表达ZmPP2C基因抑制拟南芥在胁迫下的萌发率和根的伸长 将转基因植株和野生型拟南芥播种在含有不同浓度的氯化钠和甘露醇的MS培养基上进行萌发试验。7天后,过量表达ZmPP2C基因的拟南芥相对于野生型其萌发率和根的伸长都受到抑制。而在对照状态下其萌发率和根的伸长没有明显差别。 6.转ZmPP2C基因拟南芥在逆境胁迫条件下的生理变化 为了检测转ZmPP2C基因拟南芥在胁迫条件下的变化,我们测定了一系列和植物逆境胁迫有密切关系的生理指标,包括净光合速率,游离脯氨酸的积累,MDA含量,膜透性以及失水速率等。结果表明,未处理的转基因和野生型拟南芥的这些指标没有明显变化。但是胁迫处理后,不管是野生型还是转基因植株净光合速率都下降,但野生型拟南芥下降的更明显;转基因拟南芥中Pro积累的量远远低于野生型;而转基因植株中MDA含量和失水速率均高于野生型。这些结果表明,过量表达ZmPP2C基因降低了转基因拟南芥对逆境胁迫的抗性。 7.逆境胁迫相关基因的RT-PCR分析 为了检测盐胁迫和干旱胁迫下转基因和野生型拟南芥胁迫相关基因的表达情况,选取胁迫相关基因RD29A, RD29B, P5CS1, P5CS2, ABI1和ABI2用于研究。结果表明,相对于野生型拟南芥,在高盐或干旱胁迫12到24小时内,转基因拟南芥中RD29A, RD29B, P5CS1, P5CS2表达量降低或较慢。在高盐胁迫条件下,ABI1和ABI2的表达量明显降低。在干旱胁迫下,ABI1的表达量基本不变,而ABI2表达量明显降低。 8.转基因拟南芥植株降低了对ABA的敏感性 在对照培养基上,转基因拟南芥和野生型拟南芥发芽率没有明显差别,几乎都是100%萌发,而在含有ABA的培养基上,转基因拟南芥的萌发率明显高于野生型,即转基因拟南芥对ABA的敏感性降低,根的伸长也是如此。 9.过量表达ZmPP2C基因降低了转基因玉米的抗旱性 构建表达载体pCAMBIA1301-ZmPP2C,以农杆菌介导法和基因枪法同源转化玉米齐319和18-599(红)自交系。PCR结果表明,ZmPP2C cDNA已经插入转基因玉米基因组中。RT-PCR结果也表明ZmPP2C已经在转基因玉米中表达。通过对T1代转基因玉米幼苗浇灌盐溶液和甘露醇溶液试验发现,在胁迫下转基因玉米幼苗地上部受胁迫症状较为严重。


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