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番茄紫黄质脱环氧化酶基因的体外表达及功能分析

高珊  
【摘要】: 光是植物光合作用的唯一能源,是植物生命活动的基础。然而,当植物吸收的光能超过其电子传递所需时,过剩光能便会造成光合效率和光合功能的降低,严重时还会发生光氧化破坏。植物在长期的进化过程中形成了多种光保护机制,其中叶黄素循环被认为在植物防御光破坏中起着重要作用。所谓的叶黄素循环是指植物吸收的光能过剩时,双环氧的紫黄质(V)在紫黄质脱环氧化酶(VDE)的催化下,经过中间物单环氧的花药黄质(A)转化为无环氧的玉米黄质(Z);在暗处,则在玉米黄质环氧化酶(ZE)的作用下朝相反方向进行,将Z经A重新环氧化为V,形成一个循环。其中紫黄质脱环氧化酶(VDE)和玉米黄质环氧化酶(ZE)是该循环的关键酶。 本研究以番茄(中蔬四号)为材料,利用RT-PCR的方法克隆了番茄紫黄质脱环氧化酶基因(LeVDE),并对该基因进行体外表达和功能分析。主要结果如下: 1.根据已知序列设计特异引物,通过RT-PCR的方法从番茄叶片中克隆了番茄紫黄质脱环氧化酶基因的cDNA全序列。测序结果显示,番茄VDE的cDNA全长1670bp,ORF为1437bp,推测其编码478个氨基酸,分子量为53KD,该基因被命名为LeVDE。GenBank注册号为No. FJ648424。 2.将获得的LeVDE基因成熟蛋白编码区与pET-30a(+)重组,构建原核表达载体pET::LeVDE,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达融合蛋白。通过镍离子亲和层析的方法纯化融合蛋白后免疫小鼠,制备抗体,其抗血清效价为1:500。分别对低温弱光和强光处理的番茄叶片VDE蛋白进行了Western杂交分析。结果表明,LeVDE在蛋白水平的表达始终处于稳态水平,基本不受光强和温度的影响。 3.将获得的LeVDE基因与含有35S启动子的pBI121载体重组,构建了正义和反义表达载体,利用农杆菌介导的叶盘法转化烟草,用RT-PCR和Western Blot的方法对带卡那抗性的转基因烟草进一步检测,结果证明成功地获得了转正义和反义基因的烟草植株。与野生型相比,过量表达LeVDE的烟草叶片中A和Z的相对含量较高,脱环氧化保持较高水平。LeVDE表达发生沉默的烟草植株中A和Z的相对含量较低,脱环氧化受到抑制。 4.在强光(1200μmol m~(-2)s~(-1))及低温弱光(4℃,100μmol m~(-2)s~(-1))胁迫下,野生型和转基因株系NPQ与叶黄素循环脱环氧化状态(A+Z)/(V+A+Z)都增加,与野生型相比,正义株系增加更多,反义株系增加较少。结果表明,在低温弱光及强光胁迫条件下,LeVDE的过量表达可以提高叶黄素循环的脱环氧化状态,提高了热耗散能力。 5.通过测定叶绿素荧光参数和净光合速率,探讨了过量与抑制LeVDE的表达在强光和低温弱光胁迫下对PSⅡ的影响。与野生型相比,胁迫条件下正义株系的PSⅡ最大光化学效率(Fv/Fm)、净光和速率(Pn)下降程度较小,而反义株系的下降程度较大。表明LeVDE的过量表达减轻了PSⅡ对光抑制的敏感性,而抑制LeVDE的表达加剧了PSⅡ的光抑制。


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