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鸭病毒性肝炎C3d新型分子佐剂基因疫苗的研究

裴宗飞  
【摘要】: 鸭病毒性肝炎(DVH)是雏鸭的一种烈性传染病,该病可由Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型不同类型的鸭肝炎病毒(DHV)引起,目前我国流行的主要是鸭Ⅰ型病毒肝炎。DHV结构蛋白编码区(P1区)可以编码病毒特异性结构蛋白VP0(VP2和VP4的前体)、VP3和VP1,其中VP1蛋白(外壳蛋白)具有主要的型特异性抗原中和位点,是宿主的主要保护性蛋白。 目前我国普遍采用接种鸭肝弱毒活疫苗的方式预防该病,但弱毒活疫苗普遍存在着毒力返强、自然散毒以及不便于运输保藏等缺点。核酸疫苗可诱导机体产生全面的免疫应答,并且对不同亚型的病原体具有交叉防御作用,同时具有安全、可靠、生产方便等优点,故被认为是继减毒、灭活疫苗和基因工程亚单位疫苗之后的第三代疫苗。但该类疫苗目前存在保护率较低的弊端,克服这一弊端的较好方法就是添加分子佐剂。 C3d片段是补体C3的裂解片段之一,是C3分子α链不能被蛋白酶再裂解并仍保持与抗原共价连接的最小片段,具有广泛的免疫学功能。因此,C3d被认为是基因疫苗的有效的分子佐剂。 本研究以克隆的鸭补体C3d基因作为分子佐剂,直接与DHV的VP1基因连接,然后连接到真核表达载体上,构建了DHV VP1-C3d-pcDNA3.1分子佐剂基因疫苗,并对其免疫效果进行了研究。主要研究内容如下: 试验一绍兴麻鸭补体C3d基因的克隆及序列分析 采集经油乳剂灭活苗免疫刺激的绍兴麻鸭肝组织,用液氮研磨法提取肝细胞总RNA。根据GenBank上发表的其他动物补体C3序列,自行设计一对引物,RT-PCR扩增鸭C3d基因cDNA,克隆到pMD18-T载体,转化大肠杆菌BL21,酶切鉴定后测序。PCR结果显示,在991bp处有一明亮条带,与预期大小一致;酶切产物凝胶电泳后出现了2.7 kb和1.0 kb左右的载体片段条带和插入目的片段条带,证明PCR产物已成功连接至pMD18-T载体。经软件分析基因及其氨基酸序列结果证明,成功获得了鸭C3d基因;与鸡和人的C3d基因同源性比较结果分別为87.6%和46.9%,显示出明显的种属特异性。 试验二DHV VP1基因的克隆和原核表达 收集SPF鸡胚DHV尿囊液,采用液氮研磨法提取病毒总RNA,针对GenBank已登录的DHV-VP1基因序列,自行设计一对引物,RT-PCR扩增DHV VP1基因,克隆到pMD18-T载体,转化大肠杆菌BL21,筛选阳性克隆经PCR、酶切鉴定无误后将其克隆到表达载体PGEX-6P-1,PCR结果显示,在714bp处有一明亮条带,与预期大小一致;酶切产物凝胶电泳后出现了4.9 kb和7.1kb左右的载体片段条带和插入目的片段条带,证明与载体连接成功。转化大肠杆菌诱导表达,经SDS-PAGE分析证明目的蛋白得到表达,Western-blotting证实表达的目的蛋白具有良好的反应原性。 试验三VP1-C3d-pcDNA3.1基因疫苗的构建及免疫效果的研究 重新设计一对引物,将鸭C3d基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+),构建完成包含分子佐剂C3d的真核表达载体C3d-pcDNA3.1;设计另一对引物,将DHV VP1段基因亚克隆至含分泌表达信号肽(tPA)序列的重组表达载体C3d- pcDNA3.1,克隆位置是CMV启动子下游与C3d序列上游的中间,构建完成鸭病毒性肝炎(tPA)-VP1-C3d-pcDNA3.1基因疫苗;用该疫苗对小白鼠进行免疫注射,通过检测抗体效价等指标,评价该疫苗的免疫保护效果。 建立了检测抗DHV抗体的间接ELISA方法,并对该方法的各种反应条件进行了优化;以优化的间接ELISA方法对小鼠血清抗体效价进行了检测,结果显示VP1-C3d-pcDNA3.1基因疫苗组抗体效价平均值为6.2显著高于未添加分子佐剂基因疫苗组的2.4;病毒中和试验表明该基因疫苗对DHV病毒半数致死量的10倍量及100倍量攻击保护率为100%。


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