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水稻细胞周期基因的全基因组分析与Orysa;CycB1;1调节胚和胚乳发育的研究

国静  
【摘要】: 细胞分裂是生物体生长发育的基础。近年来,细胞周期的调控机制逐渐为人们所关注。在高等植物中,细胞周期关键调节因子在双子叶模式植物拟南芥中已经被系统分析,但在单子叶模式植物水稻(Oryza sativa)中研究则较少。水稻是我国重要的粮食作物,研究水稻细胞周期的调控机制对于有目的的改善水稻的农艺性状(如加速生长、增加株高、改善株型、提高千粒重等)进而提高水稻产量有着重要的意义。水稻基因组测序的完成及大量信息学数据的出现为查找水稻细胞周期关键调节因子提供了方便。为了获得水稻所有的细胞周期关键调节因子,本研究根据拟南芥基因组提供的信息,在水稻公共数据库中进行序列检索,将检索到的序列进行了信息挖掘,进而对水稻细胞周期关键调节基因的表达模式和功能进行了初步研究。 本研究通过序列比对获得了90个水稻细胞周期关键调节因子的基因序列。这些调节因子包括44个细胞周期蛋白(Cyclin)、25个细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、7个细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(KRP)、9个E2F转录因子,另外还有2个成视网膜瘤蛋白(Rb),2个WEE激酶和1个细胞周期蛋白依赖性激酶亚单位(CKS)。对这些调节因子的蛋白序列进行了聚类分析并系统命名,其中有41个调控因子的名称是新命名的或对其原有的名称进行了更正。聚类分析以及蛋白质结构分析发现,水稻和拟南芥的细胞周期关键调节因子之间不仅在数目上是保守的,在蛋白序列和结构特征上同样比较保守。 为了研究水稻细胞周期关键调节基因在水稻发育过程中的功能,首先利用半定量RT-PCR的方法初步研究了上述基因在水稻不同组织中的时空表达模式。根据表达模式,水稻细胞周期关键调节基因大致可分为五大类。这些基因中,同一基因家族成员之间具有相似的表达模式,而不同基因家族之间表达模式差异较大。暗示不同家族的细胞周期关键调节基因在水稻发育过程中可能起着不同的作用,而同一家族的基因成员之间可能存在功能冗余。 为精确地了解水稻细胞周期关键调节基因所表达的细胞和组织,随机选取Orysa;CycA2;1、Orysa;CycB2;2、Orysa;CycU4;4与Orysa;CDKG;1四个基因进行了原位杂交分析。原位杂交结果显示水稻细胞周期关键调节基因具有时空表达特异性,特异地在细胞分裂旺盛的组织如根端分生组织、苗端分生组织以及发育的胚中表达。另外,原位杂交结果与半定量RT-PCR结果一致,证明通过半定量RT-PCR来研究基因表达模式的方法是比较可靠的。 为了研究生长素和细胞分裂素对水稻细胞周期关键基因的调节作用,利用半定量RT-PCR的方法研究了这两种激素对上述基因表达的调控模式。结果显示,生长素调控表达的基因有29个,其中有25个基因的表达水平上调,4个基因的表达水平下调;细胞分裂素调控表达的基因有37个,其中,12个基因表达上调,25个基因表达下调;在这些表达变化的基因中,18个基因的表达同时受到生长素和细胞分裂素的调节。这表明生长素和细胞分裂素能够分别或着同时调节不同水稻细胞周期关键调节基因的表达。 在种子中高水平表达的基因可能对种子的发育起着重要的作用。根据水稻90个细胞周期关键基因的表达模式,选取在种子中高水平表达的7个基因——Orysa;CycA2;1、Orysa;CycB1;1、Orysa;CycB2;2、Orysa;CDKE、Orysa;DEL1、Orysa;DP1以及Orysa;E2F4,通过遗传转化分析其在水稻种子发育过程中的功能。观察转基因水稻的表型发现Orysa;CycB1;1相关转基因水稻植株的生殖发育异常,因此,对Orysa;CycB1;1的功能进行了进一步的研究。 对转基因植株进行表型分析发现,Pubi::CycB1;1RNAi转基因水稻生殖发育异常,表现为部分花粉和子房败育、结实率降低、种子发育异常、胚乳的发育受到抑制而胚的生长得到促进。组织学分析显示,授粉后3天(3 DAP)的转基因水稻种子胚乳发育出现异常,胚与对照相比没有显著差异,9 DAP的转基因种子中胚乳几乎消失,而胚与对照相比体积则增大三至四倍。在胚乳中特异敲除Orysa;CycB1;1发现,PGluA-1::CycB1;1RNAi转基因水稻能够产生与上述表型类似的种子,表明Orysa;CycB1;1直接调控水稻胚乳的发育,同时影响胚的发育。统计结果显示,Pubi::CycB1;1RNAi转基因水稻种子胚体积增大主要是由于细胞体积增加所致,与细胞数目无关。 半定量RT-PCR、荧光实时定量PCR、原位杂交以及PCycB1;1::GUS转基因水稻种子的组织学染色结果显示,Orysa;CycB1;1在分裂旺盛的组织和细胞中表达,尤其在发育早期种子的胚和胚乳中均表达,暗示该基因对水稻种子胚和胚乳的发育起调控作用。对PGluA-1::CycB1;1RNAi转基因水稻胚乳的荧光实时定量PCR分析结果显示,种子发育相关基因FIE和GW2的表达量上调。芯片分析结果表明,Pubi::CycB1;1RNAi转基因水稻胚中,一些与发育进程、形态建成及细胞壁组织结构等相关的基因表达水平变化显著。暗示这些基因的表达可能受Orysa;CycB1;1调节。 综上所述,得出以下结论:水稻与拟南芥的细胞周期关键调节基因在数目及结构上相当保守;不同家族的水稻细胞周期关键调节基因在水稻发育过程中起着不同的作用,而同一家族成员之间可能存在功能冗余现象;生长素和细胞分裂素能够分别或着同时调节不同水稻细胞周期关键调节基因的表达;Orysa;CycB1;1的正常表达为水稻生殖发育所必需,该基因直接调控水稻胚乳的发育,并影响胚的发育;Orysa;CycB1;1可能通过调节FIE和GW2基因调控胚乳的发育;Orysa;CycB1;1可能通过调节与发育进程、形态建成及细胞壁组织结构等相关的基因调控胚的发育。


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