硫丹对生物DNA损伤和土壤微生物群落多样性的影响

【摘要】： 持久性有机污染物(简称POPs),被认为是21世纪影响人类生存与健康的重要环境问题。由于持久性有机污染物在全球普遍存在,具有生物累积性、难以降解、可远距离传输、致癌致突变性和内分泌干扰等特性,它们所引起的环境与健康问题已经引起国际环境保护组织、各国政府和民众的高度关注。硫丹为有机氯杀虫剂,具有触杀和胃毒作用,杀虫谱广,广泛用于棉花、果树、蔬菜、茶叶等作物上,我国已大面积使用。20世纪90年代以后,越来越多的国家认识到了硫丹广泛使用的危害性,许多国家开始禁用或严格限制使用。作为一种即将被列入POPs名单的污染物,硫丹对人体健康和生态环境的潜在影响问题在国内外备受关注,研究其生态毒性非常重要。鉴于土壤微生物、动物、植物在生态系统中的重要性,本研究利用分子生物学技术,采用微核实验、彗星试验和变性梯度凝胶电泳实验,研究了硫丹对蚕豆、白三叶草、蚯蚓和土壤微生物的毒性效应,评价了硫丹对生物DNA的损伤作用和土壤微生物群落多样性的影响,对于了解和认识硫丹对生态系统的影响以及为建立快速、有效、实用的生物监控和测试技术具有重要意义。主要研究结果如下: 1.为了探明硫丹对蚕豆的遗传损伤作用,采用毒理学实验方法,研究了0.1、1.0、10.0 mg/L浓度的硫丹对蚕豆根尖细胞有丝分裂、染色体畸变和微核的影响。研究结果表明,硫丹抑制蚕豆根尖细胞的有丝分裂。经硫丹处理后,蚕豆根尖细胞有丝分裂指数则逐渐降低,降低的程度随硫丹的浓度和染毒时间的增加而增强。随着硫丹的浓度和染毒时间的增加,蚕豆根尖细胞的染色体畸变率和微核率不断提高。有丝分裂指数与染色体畸变和微核率都呈负相关,染色体畸变率与微核率呈正相关,并具有明显的剂量-效应关系。在本试验条件下硫丹达到一定剂量浓度会对蚕豆根尖细胞造成DNA损伤,具有明显的遗传毒性。 2.单细胞凝胶电泳实验(彗星试验)是一种快速、简单、直接的DNA损伤研究手段,能广泛应用于多种组织来快速检测环境基因毒性物质。本文通过彗星试验测定了硫丹对蚯蚓体腔细胞和白三叶草叶片细胞DNA的损伤作用。试验结果显示,在设定的四个检测时间(7d、14d、21d、28d),经不同浓度硫丹处理,蚯蚓体腔细胞和白三叶草叶片细胞DNA均有损伤,而且随着浓度的增加和时间的延长,彗星拖尾长度、Olive尾矩的值均有上升的趋势,这说明DNA损伤程度与硫丹的浓度和处理时间均有效应关系。表明硫丹对蚯蚓和白三叶草造成了基因损伤。 本研究首次利用广泛分布的白三叶草作为受试生物材料,进行污染物的彗星试验检测试验。通过实验发现,和对照处理相比,经过硫丹处理后白三叶草叶片细胞能够通过彗星试验检测DNA损伤,而且随硫丹处理浓度的增加和暴露染毒时间的延长,细胞核产生的伤害程度也随之增加,具有较高的灵敏性。表明白三叶草叶片能应用于植物彗星实验,研究环境污染对植物DNA的损伤。 3.采用三种不同方法,分别对土壤微生物总DNA进行提取效果的比较,结果发现运用化学试剂和酶结合的策略能够获得高质量、高产量的基因组DNA,较其他方法具有明显的优势和效果,并且获得的产物经纯化后更适用于随后的分子生物学实验。 4.采用扩增细菌16Sr DNA V3区的通用引物,通过改变扩增反应体系中的Mg2+、dNTP、引物的条件,并采用Nest-PCR方法,优化了含有“GC”结构引物的PCR扩增方法,获得了较好的扩增产物,使得DGGE电泳图谱条带更清晰,可分辨的条带数量也更多。 5.利用DGGE指纹分析技术研究了硫丹对土壤微生物群落多样性的影响。通过对不同培养时间(7d、14d、21d、28d)、不同浓度(0.1、1.0、10.0 mg/kg)硫丹污染下土壤微生物DNA进行DGGE多样性的分子指纹图谱分析,发现随着培养时间不同,各处理之间的土壤微生物群落多样性出现了一定的差异。在硫丹作用下,土样中一些细菌种群的生长受到抑制,随着硫丹或作用时间的提高或延长,其相关条带由深变浅,甚至消失。而另一些细菌种群的得到富集,其条带由无到有。在整个试验过程中,随着硫丹浓度的升高,与对照相比各泳道条带间的Jaccard指数相似性相应降低,在一定浓度和作用时间范围内,硫丹对土壤细菌种群的改变的影响存在剂量-效应关系。表明硫丹对土壤微生物群落结构有着明显的影响。