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马铃薯脱氢抗坏血酸还原酶基因的克隆和功能分析

秦爱国  
【摘要】: 维生素C又称抗坏血酸(L-ascorbic acid, AsA),一种普遍存在于植物组织的抗氧化物质,也是人类必需的重要维生素。由于人体缺乏合成AsA的能力,必须从蔬菜水果中获得,因此其成为衡量蔬菜品质的一项重要指标。植物中AsA的重要性还在于提高植株的AsA水平,对于增强植物自身的抗氧化能力和光合保护能力以及促进生长发育等都具有非常重要的意义。 脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)是植物抗坏血酸-谷胱甘肽循环中的关键酶。本研究从马铃薯叶片中克隆到分别存在于细胞质和叶绿体的DHAR两个同工酶基因。研究了该基因在马铃薯各器官中表达量与AsA器官分布的关系以及其表达水平与马铃薯温度胁迫耐受能力的关系。然后分别将两种基因导入马铃薯使其过量表达,进一步研究其在马铃薯AsA代谢中的功能。主要结果如下: 1.叶片和茎的AsA+DHA含量与GalLDH活性显著相关,而AsA含量与DHAR活性显著相关。说明在马铃薯幼叶中高含量的AsA可能归因于DHAR和GalLDH的高活性;而AsA在马铃薯块茎的积累,主要来自于叶片的运输和DHAR催化的DHA再生。在地上部DHAR两同工酶基因共同调控DHAR的活性,但在块茎中主要是细胞质DHAR基因起作用。 2. 40℃和5℃下,AsA含量快速增加,而后急速减少。DHAR、GalLDH、APX、MDHAR及GR活性也呈与之相似的先升后降的变化趋势。DHAR基因表达变化趋势与其酶活性一致,说明DHAR两同工酶基因均能通过调控其表达量参与对AsA含量的调控,并以此来抵御温度胁迫对植物带来的氧化伤害。 3.从马铃薯叶片中成功获得了DHAR位于细胞质和叶绿体中两个同工酶基因的全长,命名为SrDHAR1和SrDHAR2,GeneBank注册号分别为EF030707和FJ477252。对两基因推导的氨基酸序列分析表明,SrDHAR1和SrDHAR2编码的蛋白质生理功能基本相同,唯一不同的是SrDHAR2含有叶绿体转运肽cTP,可以在蛋白质合成完成后被转运到叶绿体中。 4.将获得的SrDHAR1和SrDHAR2基因分别与含有35S启动子的pBI121载体重组,构建正义表达载体,利用农杆菌介导转化马铃薯。通过PCR及荧光定量PCR的方法对带卡那抗性的转基因植株进一步检测,结果证明成功获得了转正义基因的马铃薯植株。 5. SrDHAR1过量表达的转基因植株的叶片和块茎DHAR活性、AsA和AsA+DHA含量及AsA/DHA均比野生型显著增加。SrDHAR2过量表达的转基因植株的叶片DHAR活性、AsA和AsA+DHA含量及AsA/DHA显著增加,但块茎中上述指标没有显著变化,表明SrDHAR2仅在含叶绿体的器官中表达,在叶片中的过量表达未影响块茎DHAR活性和AsA含量。 6. SrDHAR1和SrDHAR2的过量表达均能提高叶片中叶绿素含量和叶片光合速率。并且SrDHAR2过量表达植株的叶片叶绿素含量和光合速率的增幅均大于SrDHAR1过量表达植株,说明叶绿体DHAR的过量表达对稳定植株叶绿素,增强光合作用的效果更大。 7. SrDHAR1和SrDHAR2过量表达植株表现出较其野生型更强的生长势,其植株的株高、单叶叶面积和单株叶面积均显著高于其野生型,并且转SrDHAR1基因植株的茎粗也显著高于其野生型。说明SrDHAR1和SrDHAR2过量表达均能促进植株生长。


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