ERK1/2与ROCK对话调控对脑梗死后神经血管单元的影响

【摘要】：目的 建立永久性脑缺血模型，观察脑梗死后ERK1/2和ROCK两条信号通路的变化及分别应用ERK1/2和ROCK阻断剂探讨这两条信号通路如何通过相互作用激活其共同的下游效应分子PARP-1进而来调控脑梗死后神经血管单元的存亡。 方法 一、SPF级健康、雄性SD大鼠60只，由山东中医药大学动物中心提供，体重250～300g，实验前12h禁食，自由饮水。采用随机数字表法，将大鼠随机分为假手术组(S)和脑梗死组(M)，脑梗死组采用大脑中动脉线栓法建立大脑中动脉脑缺血模型(MCAO模型),假手术组的制作方法除大脑中动脉不插线外余步骤同制作MCAO模型，每组根据脑梗死后时间不同又分为1h，3h，12h，24h，3d，7d六个亚组，每个组5只大鼠。分别采用神经功能评分表检测各组神经功能及Western Blot方法分别检测各亚组ERK1/2、p-ERK1/2、ROCK蛋白表达水平。 二、SPF健康、雄性SD大鼠40只，随机分为四组：对照组(S)，模型组(M)，U0126组(U)，Fasudil组(F)，U0126+Fasudil组(U+F)。对照组、U0126组、Fasudil组、U0126+Fasudil组分别在模型制作前30min及造模成功后12h给予大鼠尾静脉注射DMSO、ERK1/2抑制剂U0126(30mg/Kg)、ROCK抑制剂Fasudil(10mg/Kg)、U0126(30mg/Kg)+Fasudil(0.5mg/Kg)。脑梗死24小时后，分别检测各组神经功能、脑梗死面积以及脑梗死侧大脑皮层ROCK、p-ERK1/2及PARP-1的蛋白表达水平。 结果 一、假手术组各个时间点总ERK1/2和p-ERK1/2表达相同。脑梗死组各个时间点的总ERK1/2表达不变，而p-ERK1/2随时间的延长表达逐渐升高，24h时达最高峰，随后p-ERK1/2水平逐渐降低。与假手术组相应时间点比较，1h、3h组p-ERK1/2的表达量显著降低(P0.05)，然而，12h、24h组p-ERK1/2水平明显高于假手术组(P0.05)，3d和7d p-ERK1/2的表达仍高于对照组，对比有统计学意义(P0.05)。ROCKWestern blot结果显示：假手术组各亚组ROCK的表达相同。脑梗死组ROCK的表达随时间的延长逐渐升高，12h表达达高峰，随后表达下降。与假手术组相应时间点相比，脑梗死3h、12h和24h组ROCK水平明显升高(P0.05)，3d后ROCK表达与假手术组相比无差异(P0.05)。神经功能结果显示：假手术组不出现神经功能缺陷症状，脑梗死组大鼠清醒后即出现肢体功能障碍，24h组肢体功能评分最高(2.8±0.45)，其后降低，7d神经功能评分降至(1.2±0.45)。 二、模型组与对照组相比，p-ERK1/2、ROCK及PARP-1的表达显著提高(P0.05)；与模型组相比，Fasudil组p-ERK1/2及ROCK的表达下降，而U0126组p-ERK1/2的表达下降，而ROCK表达并无变化；与模型组相比，Fasudil组、U0126组及Fasudil组+U0126组PARP-1的表达显著下降，其中以U0126+Fasudil组下降最为显著；模型组与对照组相比，大鼠表现出显著的神经功能缺损症状，神经功能评分增高(2.8±0.45，P0.05)，脑梗死面积较大(26.8±3%，P0.05)。分别与模型组、U0126组、Fasudil组相比，U0126+Fasudil治疗组神经功能明显改善，神经功能评分(1.3±0.5，P0.05)，脑梗死面积(15.8±2%，P0.05)均具有统计学意义(P0.05)。结论 一、我们的研究发现ERK1/2和ROCK分别介导细胞内两条重要的信号通路，参与细胞的增殖、生长和发育等生物学功能。研究显示，脑梗死后ERK1/2和ROCK信号通路的调控与神经细胞的生存和死亡密切相关。我们实验结果证明脑梗死后24h神经功能损伤最重，而ERK1/2的表达最高，由此我们推断ERK1/2的过度激活与神经功能损伤程度有关。此时，ROCK的表达较高，表明ERK1/2和ROCK在脑梗死后发生了不同调节，参与神经损伤与修复。关于ERK1/2和ROCK在脑梗死后如何调节及可能的机制不是很清楚，需要我们进一步探索，所以我们设计下一步实验。 二、分别应用这ROCK和ERK1/2的阻断剂显示：ROCK阻断剂对ERK1/2有一定的阻断作用，然而ROCK的表达不受ERK1/2阻滞剂的影响，由此我们推断ERK1/2可能作为ROCK的下游效应分子发挥作用。PARP-1的表达受ROCK阻断剂和ERK1/2阻断剂的共同影响。由此我们推断ERK1/2可能与ROCK共同调节PARP-1的表达进而调控脑梗死后神经血管单元的存亡。