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蚊媒病毒RT-hemi-nested PCR检测方法的建立及应用

薛志静  
【摘要】:背景蚊媒病毒是指通过蚊虫叮咬敏感的脊椎动物而传播疾病的一类病毒,可以引起全球范围内流行的自然疫源性疾病。目前从蚊虫体内分离到的病毒多达260多种,其中与人类疾病密切相关的蚊媒病毒主要有黄病毒属(Flavivirus)的乙型脑炎病毒(Japan-ese encephalitis virus,JEV)、登革病毒(Dengue virus,DENV)、西尼罗病毒(West Nile virus,WNV)、黄热病毒(Yellow fever virus,YFV)以及甲病毒属(Alphavirus)的基孔肯雅病毒(Chikungunya virus,CHIKV)和辛德毕斯病毒(Sindbis virus,SINV)等,主要临床表现为发热、出血、皮疹、关节疼痛和脑炎等,严重者可导致人类死亡,蚊媒病已成为世界范围内严重的公共卫生问题。除了乙型脑炎病毒和黄热病毒外,其他病毒尚缺少有效的疫苗和治疗手段。因此,建立一种简便快速、特异性强、敏感性高的蚊媒病毒检测方法对预防和控制蚊媒病的传播具有重要的意义。目的本研究建立了基于RT-PCR技术的两套RT-hemi-nested PCR检测体系,可分别用于检测蚊媒黄病毒属病毒和甲病毒属病毒,为蚊媒病毒的早期快速诊断提供技术支持。研究方法1.引物合成自Gen Bank数据库中分别下载蚊媒黄病毒属病毒和甲病毒属病毒的全基因组序列,运用生物信息学软件分别对各病毒进行比对分析后获取保守序列,同时运用NCBI blast等软件辅助评价,最终选择出最合适的引物。2.标准品制备PCR产物回收,构建重组质粒,提取重组质粒的DNA,10倍递次稀释制成病毒标准品,以病毒标准品为模板进行RT-hemi-nested PCR检测。3.反应体系的优化对蚊媒黄病毒属和甲病毒属RT-hemi-nested PCR反应体系进行优化,通过改变引物浓度、退火温度等减少非特异性条带出现的情况。4.RT-hemi-nested PCR检测方法特异性、敏感性的评价利用特异性较好的黄病毒属和甲病毒属引物分别进行检测,验证其特异性。利用建立的RT-hemi-nested PCR方法对不同稀释度的病毒标准品进行检测,验证体系的敏感性。5.野外采集蚊虫标本的检测使用本研究建立的两套RT-hemi-nested PCR检测体系,对野外采集的蚊虫标本进行检测。利用RNA提取试剂盒提取蚊虫RNA,使用逆转录试剂盒获得c DNA,分别用蚊媒黄病毒属RT-hemi-nested PCR和蚊媒甲病毒属RT-hemi-nested PCR方法检测,并对阳性样本测序确定病毒种类。结果1.本研究建立了特异性较高的蚊媒黄病毒属RT-hemi-nested PCR检测方法,结果显示只有黄病毒属病毒样品出现了目的条带,其他对照均没有条带出现,说明引物的特异性良好。敏感性检测结果显示,JEV、DENVⅡ、YFV、WNV的检测下限值分别为3×10~4copies/μl、3×10~6copies/μl、3×10~5copies/μl、3×10~4copies/μl,而普通PCR检测JEV、YFV、WNV的下限值分别为3×10~7copies/μl、3×10~9copies/μl、3×10~7copies/μl,未检测到DENVⅡ。可见RT-hemi-nested PCR的敏感性约为普通PCR的10~3-10~4倍,大大提高了检测的敏感度并且弥补了普通PCR漏检的可能性。2.本研究建立的蚊媒甲病毒属病毒RT-hemi-nested PCR方法,特异性的检测结果显示,只有甲病毒属病毒出现了目的条带,其他对照均没有条带出现,说明引物的特异性良好。敏感性检测结果显示,SINV、CHIKV的检测下限值分别为3×10~3copies/μl、3×10~4copies/μl,而普通PCR的检测下限值分别为3×10~7copies/μl、3×10~8copies/μl。可见RT-hemi-nested PCR的敏感性约为普通PCR的10~4倍,敏感性较高。3.分别用建立的蚊媒黄病毒属和甲病毒属RT-hemi-nested PCR方法对野外采集的蚊虫标本进行检测,共检测了96组蚊虫样品,其中两组显示为黄病毒属病毒阳性,经测序鉴定分别为基因Ⅰ型乙脑病毒和基因Ⅲ型乙脑病毒;蚊媒甲病毒属病毒未扩增出阳性条带,可能与采集的蚊虫种类有关,基孔肯雅病毒和辛德毕斯病毒等甲病毒属病毒的主要传播媒介为伊蚊,而本研究中所采集的蚊虫以库蚊和骚扰阿蚊为主。结论1.本研究成功建立了针对蚊媒黄病毒属病毒RT-hemi-nested PCR检测方法,该方法特异性强、灵敏度高并能同时检测出多种病毒。2.本研究成功建立了针对蚊媒甲病毒属病毒RT-hemi-nested PCR检测方法,该方法特异性强、灵敏度高、简便快速,可用于大规模流行病学的调查,易于普及。


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