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枸杞多糖对蓝光诱导损伤的视网膜色素上皮细胞抗氧化作用机制的研究

窦冉  
【摘要】:目的:利用蓝光诱导体外培养的人视网膜色素上皮细胞损伤建立年龄相关性黄斑变性(Age-related macular degeneration, AMD)的实验模型,通过观察不同浓度的枸杞多糖对其干预,探讨枸杞多糖防治AMD的可行性。 方法:1.体外培养人视网膜色素上皮细胞(human retinal pigment epithelial cell, hRPE cell),并通过倒置相差显微镜观察其生长情况。2.配制含终浓度分别为10mg/ml、1mg/ml、0.1mg/ml、0.01mg/ml枸杞多糖的培养基体外培养hRPE细胞,通过CCK-8法筛选出适合hRPE细胞生长的枸杞多糖的安全浓度。3.实验分为五组:A组(正常RPE细胞)-正常对照组,B组(RPE+光照)-光照损伤组,C组(RPE+光照+1mg/ml枸杞多糖),D组(RPE+光照+0.1mg/ml枸杞多糖),E组(RPE+光照+0.01mg/ml枸杞多糖)。B组~E组光照采用白色冷光源,波长范围为470nm~52Onm蓝色滤光片,光照强度(2000±500)LUX的蓝光连续照射hRPE细胞12h,建立hRPE细胞光损伤模型,倒置显微镜下观察细胞形态变化。采用线粒体活性氧测定试剂盒、线粒体膜电位检测试剂盒和Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒,通过流式细胞仪进行检测线粒体活性氧、线粒体膜电位和凋亡的情况,进而研究枸杞多糖对蓝光诱导损伤的hRPE细胞的影响及可能的作用机制。 结果:1.倒置相差显微镜下见:体外培养的人视网膜色素上皮细胞(hRPE细胞)细胞呈梭形或多边形,单层贴壁生长,细胞边界清楚。2. CCK-8法检测显示:(1)加入终浓度分别为10mg/ml的枸杞多糖组OD值明显低于单纯视网膜色素上皮细胞组,差异有统计学意义(P0.05);(2)加入终浓度分别为1mg/ml、0.1mg/ml、0.01mg/ml的枸杞多糖组与单纯视网膜色素上皮细胞组OD值未见明显差异,无统计学意义(P0.05)。3.蓝光损伤模型建立后,倒置相差显微镜下观察A-E组细胞见:A组细胞呈梭形或多边形,单层贴壁生长,细胞边界清楚。B组一些细胞体积缩小,变圆,折光性改变,细胞周围见透亮圈;细胞核缩小,分裂为多个或出现核边聚;培养液中出现圆形悬浮细胞及细胞碎片。C-E组细胞呈梭形或多边形,单层贴壁生长,细胞边界清楚,少许细胞积缩小,变圆,折光性改变,培养液中未出现圆形悬浮细胞及细胞碎片。4.Annexin V-FITC/PI凋亡:(1)A组凋亡细胞数量最少;(2)B组凋亡细胞数量最多;(3)C~E组凋亡细胞数量与B组细胞差异有统计学意义(P0.05);(4) C组、D组凋亡细胞数量与A组差异无统计学意义(P0.05)。5.线粒体膜电位检测:(1)A组阳性细胞数量最多;(2)B组阳性细胞数量最少;(3)C~E组阳性细胞数量与B组细胞差异有统计学意义(P0.05);(4) C组、D组阳性细胞数量与A组差异无统计学意义(P0.05)。6.线粒体活性氧检测:(1)A组荧光度最大;(2)C~D组荧光度与B组细胞差异有统计学意义(P0.05);(4) E组荧光度与B组差异无统计学意义(P0.05)。 结论:(1)枸杞多糖的安全浓度为1mg/ml、0.1mg/ml、0.01mg/ml。(2)枸杞多糖能抑制蓝光诱导损伤的hRPE凋亡,1mg/ml和0.1mg/ml的枸杞多糖比0.01mg/ml的枸杞多糖抑制蓝光诱导的hRPE凋亡的作用更强,可能的作用机制在于枸杞多糖抑制了线粒体的活性氧水平和保护了线粒体的膜电位。


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