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枸杞多糖对人视网膜色素上皮细胞抗衰老的影响

杨茂兰  
【摘要】:年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration,AMD)是一种严重影响老年人视力的致盲性眼病,其发生与视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)的衰老密切相关。RPE细胞吞噬功能的下降、胞内脂褐素的不断累积及细胞增生能力的降低均是RPE细胞衰老的重要表现。如何延缓RPE的老年性进程,对AMD的防治有重要的临床意义。枸杞多糖是中药枸杞子的提取物,现已证明其具有清除细胞内氧自由基和脂褐素、促进细胞活性及保护细胞膜等作用。本实验以枸杞多糖为干预药物,观察不同浓度枸杞多糖对RPE细胞吞噬作用、清除RPE胞内脂褐素及对RPE细胞增生活性的影响,来探讨枸杞多糖对RPE细胞抗衰老作用的影响。 方法:1.体外培养hRPE细胞株并观察细胞生长情况;取处于对数生长期的RPE细胞,用CCK-8法筛选适合进行hPRE细胞相关实验的枸杞多糖(lycium barbarum polysaccharide,LBP)浓度。 2.枸杞多糖对RPE细胞吞噬作用的影响:用密度梯度离心法提取猪眼光感受器外节(photorecepter ourer segment,POS);用荧光显微镜定性及定量分析不同浓度枸杞多糖对hRPE细胞干预12h、24h后吞噬POS的影响。 3.枸杞多糖对RPE细胞清除脂褐素作用和细胞增生活性的影响:将POS与hRPE共养3周,建立猪POS诱导的人RPE脂褐素形成模型,通过流式细胞技术、透射电镜技术等定性及定量记录脂褐素的累积过程;并通过流式细胞技术观察不同浓度枸杞多糖干预RPE细胞12h、24h、48h后对脂褐素清除作用的影响;通过MTT比色法观察不同浓度枸杞多糖干预RPE细胞12h、24h、48h后对RPE细胞增生活性的影响。 结果:1.hRPE细胞(hRPE-19细胞株)呈长梭型或多边形,单层贴壁生长,胞浆丰富、透明,胞核透亮,细胞边界清晰。用CCK-8法检测枸杞多糖干预后hRPE细胞吸光度值(OD),筛选出适于人hRPE细胞实验的枸杞多糖药物浓度分别为10ug/ml、100ug/ml、1000g/ml,来用于实验研究;浓度为10mg/m1、100mg/m1组与未加药物组hRPE细胞吸光度(0D)值比较明显降低,即抑制hRPE细胞的活性,不可用于实验研究。 2. Optiprep密度梯度法可以提取到较高纯度的光感受器外节(POS),制备好的POS光镜下大小均匀,呈棒状;浓度为100ug/ml、1000um/ml组的hRPE细胞平均吞噬POS的荧光面积明显大于对照组(P0.01),即其吞噬POS的数量多于对照组;浓度为10ug/m1组的hRPE细胞吞噬POS的荧光面积较对照组未见明显差异(P0.05)。结果示较高浓度范围内的枸杞多糖对人RPE细胞的吞噬功能有一定的促进作用。 3.通过荧光显微镜和投射电镜技术可以观察到hPRE与POS共培养3周后,可以成功造出RPE脂褐素累积模型;浓度分别为10ug/ml、100ug/ml、1000g/ml的枸杞多糖作用于hRPE12h、24h、48h后,各实验组细胞脂褐素的清除面积大于对照组,且有明显差异(P0.01),并与浓度和作用时间呈正相关;浓度分别为10ug/ml、100ug/ml、1000g/ml的枸杞多糖作用于h RPE12h、24h、48h后,实验组细胞的增生活性优于对照组,且有统计学意义(P0.01);并随药物作用时间的延长而增强。 结论:1.枸杞多糖在较低浓度范围内对hRPE细胞的生长无不良影响;在较高浓度范围会抑制细胞生长。 2.枸杞多糖在本实验的浓度范围内有提高hRPE细胞的吞噬功能的作用。 3.枸杞多糖在本实验的浓度范围内能够促进hRPE细胞对脂褐素的清除并且能够提高细胞的增生活性。 4.枸杞多糖对人RPE细胞吞噬功能、清除脂褐素功能及自身增生活性的促进作用说明枸杞多糖对视网膜色素上皮有抗衰老的作用,进而可能对年龄相关性黄斑变性的预防及治疗有一定的作用,为枸杞多糖治疗年龄相关性黄斑变性提供了体外细胞学实验依据。


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