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H19/IGF2印迹模型中miR-483和miR-675功能研究

张小刚  
【摘要】:H19/Igf2(胰岛素样生长因子2,insulin-like growth factor 2)印迹基因隶属于一个基因印迹群,分别位于人染色体11P15.5,在进化上具有高度的保守性。H19基因为母源性印迹基因,而Igf2基因为父源性印迹基因,两者相距90kb,表达调控相关,对个体的生长、发育及行为发展有重要的作用。H19/Igf2印迹基因在基因结构和类型上涉及到了编码基因、非编码基因、印迹基因、宿主基因、内含子基因、microRNA基因和反义基因,是研究基于RNA介导的遗传信息表达调控网络模式的最佳模型之一。 首先,为研究H19/Igf2印迹基因模型中miR-483、miR-675及其宿主基因Igf2、H19之间在不同遗传背景、不同生理病理状态下共同的表达模式和表达调控规律,我们选取各种不同的细胞系,同时利用不同实验手段,检测分析上述各基因之间的表达调控关系,建立其表达调控模型。其次,本研究同时关注了miR-483的靶基因的预测和筛选,筛选获得了miR-483的一个靶基因-PDGFB (血小板来源的生长因子,platelet-derived growth factor beta polypeptide),为下一步继续研究miR-483的功能以及调控奠定基础。 取得的主要进展有: 1.Igf2及H19基因除在少数细胞系中皆低表达外,在多数细胞系中其表达呈拮抗关系;而miR-483及miR-675在各细胞系中的表达与其宿主是协同一致的。结果显示,Igf2基因在HEK-293T、A549细胞中表达相对较高,而在HepG2、HeLa、HCC-Lm3及BEL-7402细胞中表达水平较低;H19基因在HepG2和HeLa、HCC-Lm3及BEL-7402细胞中表达相对较高,而在HEK-293T和A549细胞中表达水平较低;而在K562细胞中两者皆低表达;miR-483及miR-675在各细胞系中的表达与其宿主是协同一致的。 2.miR-483很可能参与IGF2信号通路介导的肿瘤细胞的增殖和凋亡调控。结果显示,Chromeceptin处理HEK-293T、A549和HepG2细胞6h后,IGF2与miR-483在各细胞中表达变化不一致,IGF2在各细胞中的表达水平无明显变化,而miR-483则表达明显下调。Chromeceptin很可能通过抑制IGF2信号通路抑制了miR-483的生成过程,从而使成熟miR-483的表达下调。 3.miR-483及miR-675表达会受其他因子的调控而与其宿主基因的表达不一致。结果显示,CoCl_2诱导HepG2、HeLa和A549细胞缺氧24h后,miR-483及miR-675在各细胞系中的表达与其宿主基因Igf2及H19的表达皆不一致。HepG2和HeLa细胞中H19表达无明显变化,A549细胞中H19的表达有所下调,而各细胞中miR-675的表达明显上调;各细胞中IGF2表达皆下调,而miR-483的表达明显上调。缺氧上调miR-483与miR-675的表达很可能是通过介导其生成,促进其表达水平上调。miR-483与miR-675具有其各自独特的加工机制。 4.Igf2是miR-483的宿主基因,miR-483却能反馈下调Igf2基因的mRNA表达水平; miR-675能够抑制其宿主基因H19对IGF2的下调,而上调IGF2的表达。结果显示,过表达miR-483后IGF2的表达水平下调,而对H19的表达没有影响。同时,过表达miR-675后,H19表达无明显变化,而IGF2则表达上调。初步认为,miR-675可能负反馈调节其宿主基因H19的功能,促进IGF2的表达。 5.筛选得到了miR-483的一个靶基因-PDGFB。过表达miR-483后PDGFB的mRNA水平下调初步认为PDGFB是miR-483的候选靶基因;双荧光素酶报告基因证实,miR-483能够直接作用于PDGFB的3’UTR区;过表达miR-483后可以显著抑制HepG2细胞中内源PDGFB蛋白的表达;Chromeceptin处理HepG2细胞6h及12h后,PDGFB的表达明显上调;而CoCl_2缺氧诱导处理HepG2细胞6h及24h后,PDGFB的表达明显下调。 综上,本研究揭示了H19/Igf2印迹模型中,miR-483,miR-675及其宿主基因Igf2,H19在不同细胞系中的共同的表达规律以及调控关系,同时筛选获得了miR-483的一个靶基因-PDGFB。


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